Pour commencer, maintenir les cellules dans une fiole de culture de 75 centimètres carrés. Aspirer le milieu de culture et rincer les cellules avec du PBS sans calcium ni magnésium. Ensuite, ajoutez deux millilitres d’EDTA à 0,25% de trypsine pour détacher les cellules d’adhérence.
Incuber pendant cinq minutes à température ambiante et remettre les cellules en suspension dans 10 millilitres de milieu. Ensuite, collectez les cellules du ballon dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Centrifuger à 480 G pendant cinq minutes à température ambiante et aspirer le milieu.
Remettez les cellules en suspension dans 5 à 10 millilitres de milieu en fonction de la confluence originale de la culture. Retirez 100 microlitres de cellules et ajoutez-les à un tube de 1,5 millilitre contenant 100 microlitres de bleu trypan à 0,4%. Ajoutez les cellules à l’hémocytomètre et comptez-les en les observant au microscope et en utilisant le compteur de comptage manuel.
Diluer les cellules à trois fois 10 à la quatrième cellule par millilitre dans le milieu de culture sans rouge de phénol. Ajouter 2,5 millilitres de la suspension cellulaire à chaque puits d’une plaque à six puits avec un couvercle revêtu de poly-D-lysine selon les instructions du fabricant. Cultivez les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone dans un incubateur humidifié pour permettre la fixation des cellules à la glissière de couverture.
Le lendemain, examinez la fixation des cellules sous un microscope inversé à l’aide d’un objectif 20X. Préparer les solutions mères de traitement aux concentrations souhaitées et créer un témoin sur support uniquement, un témoin sur véhicule uniquement à une concentration qui correspond au composé d’essai et un témoin avec l’ionophore FCCP et les composés d’essai. En travaillant avec un couvercle à la fois, ajoutez 1,8 millilitre de milieu pour la condition à l’étude aux cellules.
Incuber les cellules traitées avec le composé témoin ou le composé d’essai à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone dans un environnement humidifié pendant la durée souhaitée. Après la période de traitement, ajoutez 200 microlitres de TMRE 10X aux cellules. Incuber pendant 15 à 30 minutes à 37 degrés Celsius dans un environnement humidifié à 5% de dioxyde de carbone.
Aspirez doucement le milieu et rincez les cellules deux fois avec du PBS pour minimiser les interférences de fond. Ensuite, retournez le couvercle sur une lame de microscope étiquetée avec les conditions de traitement. Image les cellules vivent à une excitation de 549 nanomètres et une émission de 575 nanomètres.
Utilisez un microscope confocal pour capturer plusieurs champs Z-stack avec une capture d’image à grande vitesse avant que l’intégrité de la cellule ne soit perdue. Enregistrez et stockez le fichier image pour une analyse ultérieure. Les cellules avec des mitochondries actives ont conservé la coloration TMRE et ont montré une fluorescence élevée.
Les mitochondries dépolarisées ou inactives ont un potentiel membranaire réduit, ne parviennent pas à retenir l’EMRT et présentent un faible signal de fluorescence.
