Libérer les complexes du cycle chromatin lexA CBP des billes magnétiques utilisées pour purifier le locus du gène de la chromatine à copie unique en incubant les abeilles avec deux microlitres de virus de gravure du tabac recombinant marqué 6xHis, ou protéase TEV. Après avoir séparé les abeilles de l’éluat final à l’aide d’un transfert magnétique à crémaillère, l’éluat contenant des cycles de chromatine clivés est envoyé dans un nouveau tube de réaction de 1,5 millilitre. Encore une fois, placez les tubes sur une grille magnétique pour séparer les billes résiduelles de l’éluat final.
Remettre les billes en suspension dans 750 microlitres de tampon de carbonate d’ammonium froid avant de stocker certains échantillons à 20 degrés Celsius pour l’analyse de l’ADN et des protéines. À partir de l’éluat final, retirez les échantillons et stockez-les à 20 degrés Celsius pour l’analyse de l’ADN et des protéines. De plus, prélevez des échantillons des billes résiduelles.
Commencez l’élution de dénaturation en lavant les billes magnétiques deux fois dans 750 microlitres de tampon de carbonate d’ammonium froid pendant 20 minutes chacune, quatre degrés Celsius tournant à 20 tours par minute. Ensuite, ajoutez 500 microlitres d’hydroxyde d’ammonium à 0,5 molaire aux billes pour extraire les complexes de chromatine lexA liés et incubez pendant 30 minutes à température ambiante. Séparez les billes de la suspension à l’aide d’une crémaillère magnétique et transférez l’éluat dans un tube de réaction à faible liaison.
Incubez le tube de réaction à faible adhérence à température ambiante pendant 30 minutes et séparez les billes de la suspension à l’aide d’une grille magnétique. Une fois cela fait, transférez l’éluat dans un tube de réaction à faible liaison. Remettre les billes en suspension dans 750 microlitres d’eau déminéralisée et prélever des échantillons pour l’analyse de l’ADN et des protéines.
Enfin, prélever des échantillons d’analyse d’ADN et de protéines à partir de l’éluat final. Dans l’étude, l’efficacité de purification du locus ARS316 et de la souche de recombinaison a été quantifiée et comparée au locus témoin PDC1. Le locus ARS316 a montré une récupération plus faible dans l’écoulement par rapport à PDC1.
Bien qu’une fraction des cycles de chromatine soit restée liée aux billes de TEV en raison d’un clivage incomplet de la protéase TEV, l’élution de dénaturation a entraîné une récupération de 80 à 90 % du locus ARS316. Cela correspond à l’enrichissement élevé des molécules ARS316 dans les billes TEV et les fractions d’élution de dénaturation en tenant compte de la taille du génome de la levure par rapport à la souche témoin qui n’a montré aucun enrichissement du locus ARS316 dans aucune des fractions quantifiées. Après l’élution du TEV, les billes ont montré un pourcentage de récupération plus élevé du locus ARS316 car l’efficacité de clivage du TEV n’était pas de 100 %, ce qui a entraîné une fraction des cycles de chromatine restant liés aux billes.
Cependant, l’élusion dénaturante a montré une récupération de 80 à 90% du locus ARS316 et de la souche de recombinaison correspondant à l’enrichissement élevé des molécules ARS316 en tenant compte de la taille du génome de la levure.
