À l’aide d’un microscope confocal et d’un objectif 40X, créez un profil de balayage avec les canaux fluorescents appropriés pour le marqueur lipidique utilisé. Après avoir configuré le mode d’acquisition et les canaux, optimisez la stratégie de mise au point en cliquant sur Autofocus logiciel. Réglez ensuite la plage de la pile Z sur 20 microns.
Après cela, optimisez les tuiles et ouvrez la visionneuse pour sélectionner les positions des tuiles. Ensuite, à l’aide d’une méthode de traitement d’image par lots, créez des projections maximales de chaque pile Z avec la méthode de profondeur de champ étendue. Avant d’exporter les images, réglez la compression sur aucune et assurez-vous que les données d’origine sont vérifiées.
L’image résultante est un TIFF en niveaux de gris de projection maximale du canal de fluorescence uniquement, exprimant le marqueur lipidique. Identifiez les images TIFF représentant Nile Red, BODIPY ou APOE et déplacez-les dans le dossier Images d’un répertoire nommé Nile Red, BODIPY ou APOE, selon la méthode utilisée. Ouvrez le logiciel de l’unité lipidique.
Dans l’onglet Prédire, sélectionnez le répertoire approprié en cliquant sur les points de suspension et en accédant au répertoire nommé. Confirmez que l’unité lipidique a correctement identifié les images en vérifiant l’entrée de classe. Cliquez sur Prédire pour observer la progression de la tâche, puis, à l’aide de l’outil Analyse de masque, parcourez les masques générés et fournissez un décompte quantitatif des dépôts lipidiques seuils à partir des images de masque.
La différenciation et la maturation réussies de l’EPR ont montré une monocouche confluente avec une pigmentation et une morphologie polygonale. En revanche, la différenciation infructueuse a montré des grappes de cellules mourantes. Sur les images en fluorescence, les dépôts de rouge du Nil et de BODIPY apparaissaient sous la forme de petits points circulaires brillants.
Un résultat négatif montre une segmentation incorrecte de l’image en confondant la fluorescence de fond avec un dépôt, soit en raison d’une faible coloration, soit d’une intensité de fond élevée. Les dépôts d’APOE varient en taille, en forme et en intensité du signal et nécessitent une optimisation des méthodes de coloration et d’imagerie pour minimiser les variations sont présentés.
