Pour commencer, dissoudre la poudre de rouge du Nil dans de l’acétone à une concentration de trois milligrammes par millilitre. Incuber la solution pendant 15 minutes à température ambiante en mélangeant périodiquement. Filtrez la solution à l’aide d’un filtre de 0,22 micromètre une ou deux fois selon la quantité de précipité restant dans la solution.
Préparez ensuite la solution de travail en diluant la solution mère dans un rapport de un à 500 dans le DPBS. Ajouter 200 microlitres de la solution de travail aux cellules RPE fixées au paraformaldéhyde et incuber pendant 30 minutes à température ambiante sur un agitateur à l’abri de la lumière. Après l’incubation, lavez les échantillons deux fois avec du DPBS, puis ajoutez 200 microlitres de DPBS et conservez-les à quatre degrés Celsius.
Pour la coloration BODIPY, préparer une concentration de 3,8 millimolaires en dissolvant BODIPY dans du DMSO anhydre. Préparez ensuite la solution de travail en diluant la solution mère dans un rapport de un à 300 dans le DPBS. Ajouter 200 microlitres de la solution de travail de BODIPY aux cellules d’EPR fixées au paraformaldéhyde et incuber pendant la nuit sur une bascule à température ambiante.
Le lendemain, lavez les cellules deux fois avec du DPBS et ajoutez 200 microlitres de DPBS avant de les stocker à quatre degrés Celsius. Pour l’immunomarquage APOE, préparez une solution tampon en combinant le DPBS avec 1 % de BSA, 0,5 % Tween 20 et 0,5 % de Triton X-100. Bloquer et perméabiliser les cellules d’EPR fixées au paraformaldéhyde dans 200 microlitres de solution tampon pendant une heure.
Après l’incubation, ajouter l’anticorps primaire APPLE dilué à raison de 1 à 100 dans la solution tampon et incuber pendant la nuit à température ambiante. Le lendemain, lavez les échantillons deux fois avec du DPBS. Ajoutez ensuite 200 microlitres de solution d’anticorps secondaire diluée à un pour 1000 pendant une heure à température ambiante.
Après l’incubation, lavez les cellules deux fois avec du DPBS et ajoutez 200 microlitres de DPBS avant de les stocker à quatre degrés Celsius.
