Pour commencer, allumez le microscope, la source lumineuse, la caméra et le système d’aspiration. Pour laver le système de perfusion, utilisez la solution de Ringer dans la première chambre et la solution de zinc de Ringer complétée par de la pyrithione dans la deuxième chambre. Après avoir fermé le robinet, remplissez les chambres avec les mêmes solutions.
Pour commencer la préparation de l’échantillon, placez la chambre de perfusion avec le côté étroit de la rainure vers le haut et appliquez un silicone d’étanchéité autour de la rainure. Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler fine, transférez une lamelle de 13 millimètres de la solution de lavage sur le dessus de la rainure avec les cellules vers le bas. Placez une lamelle de 22 millimètres sur la lamelle de 13 millimètres et serrez-la à l’aide de la pince à épiler en prenant soin de ne pas fissurer les lamelles.
Retournez la chambre et appuyez dessus pour libérer les liquides. Ensuite, remplissez la rainure avec 100 microlitres de solution de lavage Ringer et appuyez à nouveau pour éviter les fuites. Montez et fixez la chambre de perfusion sur la plate-forme.
Ensuite, fixez les tubes de perfusion et d’aspiration pour la perfusion sur les cellules de la rainure. Modifiez le débit de perfusion à environ deux millilitres par minute et activez la perfusion de la solution de Ringer. Pour les mesures, ouvrez le logiciel d’imagerie.
Réglez le grossissement du microscope sur 10X à l’aide du bouton latéral gauche du microscope. Après avoir choisi Live View, utilisez le joystick pour déplacer la plate-forme et vous concentrer sur les cellules du sillon. Sélectionnez la longueur d’onde appropriée pour mCherry.
Une fois les cellules mises au point, déplacez la plate-forme pour sélectionner les patchs cellulaires appropriés. Sélectionnez le menu déroulant Dessiner des ROI. Choisissez Draw Circular ROIs (Dessiner des ROI circulaires) et dessinez des ROI sur des clusters de cellules avec les cellules exprimant mCherry.
Créez de nouveaux ROI au-delà du premier en maintenant le bouton Maj enfoncé, puis en appuyant sur les ROI existants et en les faisant glisser. Sélectionnez Dessiner le retour sur investissement de l’arrière-plan carré dans le menu déroulant et ajustez l’emplacement et la taille du retour sur investissement de l’arrière-plan lorsque les cellules ne sont pas présentes. Après vous être assuré de l’absence de cellules dans le ROI d’arrière-plan, allez dans l’onglet Acquisition ND.
Sélectionnez le sous-onglet Longueur d’onde et cochez sa case. Assurez-vous que la case de la longueur d’onde GFP est également cochée. Cliquez sur le sous-onglet Temps et définissez l’intervalle de mesure toutes les cinq secondes et la durée 30 minutes.
Sur le panneau du microscope, appuyez sur la touche On pour activer le système de mise au point parfaite, ou PFS. Sous Acquisition ND, assurez-vous que PFS on est coché. Ajustez la mise au point et cliquez sur Exécuter maintenant.
Commencez la mesure de la période de référence pendant 90 secondes à l’aide de la perfusion de solution de Ringer. Après 90 secondes, passez de la perfusion de la solution de Ringer à la perfusion de la solution de zinc de Ringer, et cliquez sur le drapeau rouge en bas à droite du panneau d’interface principal une fois que l’augmentation de la fluorescence commence à saturer. Revenez à la perfusion avec la solution de Ringer jusqu’à l’expiration du temps d’expérience.
Pour exporter les données avec soustraction de ligne de base, appuyez sur le bouton Correction de l’arrière-plan et affichez les modifications dans la fenêtre Acquisition ND. Cliquez sur le bouton Exporter pour enregistrer les données à l’emplacement souhaité. Une augmentation de la fluorescence résultait d’une augmentation de la concentration intracellulaire de zinc, tandis qu’une diminution indiquait l’activité du ZnT-1 transportant le zinc à travers la membrane cellulaire.
Le type sauvage ZnT-1 avait une courbe de fluorescence plus lisse que le mutant, liée à la variabilité des réponses cellulaires à la charge en zinc. Une boîte à moustaches comparant les activités de l’USCTD de type sauvage et delta a montré des taux de transport moyens similaires, ce qui indique un manque de différence entre le type sauvage et le mutant. Cependant, la différence dans l’écart peut indiquer une différence fonctionnelle.
