Raz Zarivach est soutenu par la Fondation israélienne pour la science (subvention n° 163/22). Tomer Eli Ben Yosef et Arie Moran sont soutenus par la Fondation israélienne pour la science (subvention n° 2047/20). Nous tenons à remercier Daniel Gitler et son groupe de l’Université Ben Gourion pour leur coopération, leur soutien et leur expertise.

1. Transfection cellulaire
<ol><li>Cultiver des cellules HEK293T dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 2 mM de L-glutamine et 1x pénicilline/streptomycine (voir le tableau des matériaux) dans un incubateur humidifié à 37 °C/5 % de CO2 jusqu’à la confluence sur une plaque de 10 cm (8,8 x 106 cellules au total).</li>
	<li>Placez une lamelle de 13 mm dans chacun des puits d’une plaque à 12 puits. Diluer 0,44 x 106 cellules trypsinisées de l’étape 1.1 dans 12 mL de DMEM complet. Bien mélanger en pipetant de haut en bas trois à cinq fois. Remplir chaque puits avec 1 mL de la solution mélangée. Cultivez dans un incubateur humidifié à 37 °C/5 % de CO2 pendant la nuit.</li>
	<li>Remplacer le DMEM complet dans chaque puits par 1 mL de DMEM sans sérum (voir le tableau des matériaux) dans chaque puits. Remettez la plaque à 12 puits dans l’incubateur humidifié comme à l’étape 1.1.</li>
	<li>Pour chaque puits de transfection, diluer 1 μg de plasmide pAAV2 contenant la protéine d’intérêt marquée avec la protéine fluorescente mCherry (Fichier supplémentaire 1) dans 100 μL de DMEM sans sérum dans un tube de 1,5 mL.</li>
	<li>Ajouter 3 μg de polyéthylèneimine (PEI, voir le tableau des matériaux) à 100 μL de DMEM sans sérum par transfection, chaque transfection étant effectuée dans un tube différent de 1,5 mL. Le rapport plasmide/PEI doit être de 1 :3 (μg :μg).</li>
	<li>Faire tourner les deux tubes de l’étape 1.4 et de l’étape 1.5 pendant 10 s et laisser reposer à température ambiante pendant au moins 5 min.</li>
	<li>Mélanger une partie (100 μL par puits) de la solution d’ADN de l’étape 1.4 avec une partie (100 μL par puits) de la solution PEI de l’étape 1.5. Faire tourner la solution finale pendant 10 s et laisser reposer à température ambiante pendant au moins 20 min et jusqu’à 6 h.</li>
	<li>Prenez la plaque à 12 puits de l’incubateur. Vortex la solution finale de l’étape 1.7 et ajouter 200 μL à chacun des puits de la plaque à 12 puits de l’étape 1.3. Remettez la plaque à 12 puits dans l’incubateur humidifié (étape 1.1).</li>
	<li>Après 3 h, remplacer le milieu dans chaque puits par 1 mL de DMEM complet. Remettez la plaque à 12 puits dans l’incubateur humidifié comme à l’étape 1.1.</li>
	<li>Après 2 jours, prélevez la culture cellulaire transfectée de l’incubateur à 37 °C/5 % de CO2 et placez-la sur un microscope à fluorescence inversée en utilisant un grossissement de 10x.</li>
	<li>À l’aide de la molette de mise au point du microscope, faites la mise au point sur les cellules tout en utilisant la lumière à fond clair.</li>
	<li>Passez aux longueurs d’onde fluorescentes d’excitation mCherry (587 nm) et d’émission (610 nm) et éteignez la lumière à fond clair. Vérifiez la fluorescence des cellules pour confirmer l’expression de ZnT1 mCherry.</li>
	<li>Préparez la solution de charge du colorant.<ol><li>Prélever une aliquote de 4 μL de colorant fluorescent spécifique du zinc (voir Tableau des matériaux) sous forme d’ester d’acétoxyméthyle (AM), dissous dans du DMSO (1 μg/μL), provenant d’un stock à l’abri de la lumière stocké dans un congélateur à −20 °C. Cette forme permet au colorant de pénétrer dans la cellule à travers la membrane plasmique par simple diffusion.</li>
		<li>Ajouter 4 μL d’acide pluronique à 10 % (ou 2 μL d’acide pluronique à 20 %, voir le tableau des matériaux) à l’aliquote de l’étape 1.13.1. Mélangez bien la solution en pipetant trois fois de haut en bas, puis ajoutez les 8 μL dans un tube de 1,5 mL.</li>
		<li>Ajouter 750 μL de solution de Ringer (préparée à l’interne, voir le tableau des matériaux pour la composition) complétée par 1 mg/mL (~0,1 %) d’albumine sérique bovine dans le tube à partir de l’étape 1.13.2, et tourbillonner vigoureusement. Ajouter 750 μL supplémentaires de la même solution, puis tourbillonner à nouveau pour assurer un mélange maximal.</li>
	</ol></li>
	<li>Ajouter 750 μL de la solution finale de l’étape 1.13.3 à deux puits dans une nouvelle plaque de culture à 6 puits. Couvrir de papier d’aluminium. REMARQUE : Pour éviter le blanchiment, la plaque à 6 puits est toujours recouverte de papier d’aluminium à partir de cette étape.</li>
	<li>À l’aide d’une pince à épiler fine, prélevez jusqu’à quatre lamelles de répétition de la plaque de culture cellulaire transfectée et placez-les dans le premier puits rempli (jusqu’à quatre lames par puits) de la nouvelle plaque à 6 puits de l’étape 1.14. Répétez ce processus pour le deuxième puits rempli. REMARQUE : Toutes les lamelles dans le même puits rempli doivent être du même état. Cependant, chaque puits peut contenir des conditions différentes.</li>
	<li>Couvrir de papier d’aluminium et agiter doucement pendant 15 à 20 minutes.</li>
	<li>Retirez la solution de charge de colorant et remplacez-la par une nouvelle solution de lavage de Ringer’s plus albumine, comme utilisé à l’étape 1.13.3. Couvrir de papier d’aluminium. Laisser agiter à nouveau pendant 20 min. Cela permet le clivage de l’ester AM par les estérases intracellulaires.</li>
</ol>2. Préparation du microscope
<ol><li>Disposer les outils nécessaires (voir tableau des matériaux) comme mentionné : un microscope à fluorescence inversé capable de détecter les fluorophores GFP et mCherry, un système de perfusion qui permet de basculer entre au moins deux solutions, un système d’aspiration et une chambre de perfusion.</li>
	<li>Allumez le microscope, sa source de lumière et l’appareil photo. Allumez le système d’aspiration.</li>
	<li>Lavez le système de perfusion. Laver la première chambre avec la solution de Ringer et la deuxième chambre avec la solution de Ringer contenant une solution de zinc de 7 μM complétée par 7 μM de pyrithione (ionophore de zinc, voir le tableau des matériaux). Pour éviter les bulles d’air ou les interstices, laissez un peu de liquide dans chaque chambre. REMARQUE : Étant donné que les deux récipients sont connectés au même tube accroché à la chambre de perfusion, assurez-vous toujours que le segment partagé est lavé avec la solution de Ringer.</li>
	<li>Fermez les robinets et remplissez les chambres appropriées avec la solution de Ringer et la solution de zinc de Ringer, comme à l’étape 2.3.</li>
</ol>3. Préparation de l’échantillon
<ol><li>Prenez la chambre de perfusion et placez-la avec le côté étroit de la rainure vers le haut. REMARQUE : La rainure est un trou au milieu de la chambre de perfusion. Il permet au liquide de perfusion d’accéder aux cellules. Un côté de la rainure est étroit et le côté opposé est large.</li>
	<li>Appliquez un silicone d’étanchéité (voir tableau des matériaux) autour de la rainure. Nettoyez le silicone d’étanchéité de la rainure à l’aide d’une pointe de pipette. REMARQUE : Assurez-vous qu’il y a suffisamment de joint en silicone autour de la rainure pour sceller une lamelle de 22 mm.</li>
	<li>À l’aide d’une pince à épiler fine, prenez une lamelle de la solution de lavage et placez-la sur le dessus de la rainure avec les cellules vers le bas. De cette façon, les cellules seront exposées à la solution perfusant le sillon pendant l’expérience.</li>
	<li>Placez une lamelle de 22 mm sur la lamelle de 13 mm et serrez-la à l’aide de la pince à épiler. Veillez à ne pas fissurer les lamelles.</li>
	<li>Retournez la chambre et appuyez dessus pour libérer tous les liquides présents. Remplissez la rainure avec 100 μL de solution de lavage Ringer et appuyez à nouveau pour vous assurer qu’il n’y a pas de fuite. REMARQUE : Si une fuite est détectée, appliquez un agent d’étanchéité sur le site de la fuite et refaites le test.</li>
	<li>Montez la chambre de perfusion sur la plate-forme et fixez-la. Placez les tubes de perfusion et d’aspiration pour permettre la perfusion sur les cellules dans le sillon.</li>
	<li>Modifiez le débit de perfusion à environ 2 mL/min et activez la perfusion de la solution de Ringer. Assurez-vous que le système de perfusion fonctionne sans fuite ni débordement.</li>
</ol>4. Préparation de la mesure
<ol><li>Ouvrez le logiciel d’imagerie (voir Table des matériaux) en double-cliquant sur l’icône. Connectez-vous avec les informations d’identification appropriées. Choisissez la caméra connectée, puis appuyez sur OK.</li>
	<li>Réglez le grossissement du microscope sur 10x à l’aide du bouton situé sur le côté gauche du microscope.</li>
	<li>En choisissant l’affichage en direct et en utilisant le joystick, déplacez la plate-forme pour vous concentrer sur les cellules du sillon.</li>
	<li>Pendant que la perfusion est allumée, éteignez les lumières et changez la longueur d’onde en mCherry en appuyant sur le bouton dédié dans l’interface. Ajustez la mise au point à l’aide de la molette de mise au point du microscope.</li>
	<li>Une fois que le microscope est focalisé sur les cellules, déplacez la plate-forme à l’aide du joystick pour permettre la sélection des patchs cellulaires appropriés. REMARQUE : Une zone appropriée est considérée comme une zone avec au moins 10 cellules pour un ROI et une zone vide pour l’arrière-plan.</li>
	<li>Sélectionnez le menu déroulant Activer/désactiver les ROI , puis choisissez Dessiner des ROI circulaires.</li>
	<li>Dessinez les ROI des groupes de cellules avec les cellules exprimant mCherry (indique l’expression de ZnT1).</li>
	<li>Dans la même barre d’outils qu’à l’étape 4.6, cliquez sur le bouton Activer/désactiver les ROI en arrière-plan et ajustez l’emplacement et la taille du retour sur investissement en arrière-plan sur une zone sans aucune cellule.<ol><li>Vérifiez avec les longueurs d’onde mCherry et EGFP pour vous assurer qu’aucune cellule n’est dans le retour sur investissement d’arrière-plan sélectionné. REMARQUE : Les longueurs d’onde ont été ajustées de manière à ce que mCherry utilise une longueur d’onde d’excitation de 520 nm et une longueur d’onde d’émission de 610 nm et que l’EGFP utilise une longueur d’onde d’excitation de 470 nm et une longueur d’onde d’émission de 520 nm.</li>
	</ol></li>
	<li>Sélectionnez le sous-onglet Longueur d’onde (λ). Cochez sa case et assurez-vous que la longueur d’onde GFP est présente et que sa case est cochée. Si ce n’est pas le cas, ajoutez-le et marquez-le.</li>
	<li>Sélectionnez le sous-onglet Durée . Définissez l’intervalle de mesure toutes les 5 s et modifiez le nombre d’intervalles en fonction de la durée de l’expérience.</li>
	<li>Dans la section Mise au point du panneau du microscope sous l’oculaire, cliquez sur le bouton Activé pour activer le système de mise au point parfaite (PFS).</li>
	<li>À l’aide de la molette de mise au point PFS, réglez la mise au point. Dans l’interface du logiciel, sous ND Acquisition, assurez-vous que PFS on est coché.</li>
	<li>Cliquez sur Exécuter maintenant.</li>
</ol>5. Procédure expérimentale
<ol><li>Commencez par une mesure de la période de référence de 90 s à l’aide de la perfusion de solution de Ringer.</li>
	<li>Une fois la période de référence terminée, éteignez la perfusion de la solution de Ringer, puis activez la perfusion de la solution de zinc de Ringer. Marquez le changement de solution en cliquant sur le drapeau rouge en bas à droite du panneau d’interface principal. On s’attend à ce qu’une augmentation de la fluorescence apparaisse.</li>
	<li>Une fois que l’élévation de fluorescence commence à saturer, revenez à la perfusion avec la solution de Ringer. Désactivez la perfusion de la solution de zinc du Ringer, puis activez la perfusion de la solution du Ringer.</li>
	<li>Patientez jusqu’à l’expiration du délai d’expérimentation. Une diminution notable mais constante de la fluorescence est attendue si le ZnT1 fonctionne correctement.</li>
</ol>6. Exportation des données
<ol><li>Pour exporter les données avec soustraction de la ligne de base, appuyez sur le bouton Soustraire la ligne de base et affichez les modifications dans la « fenêtre d’acquisition ND ».</li>
	<li>Cliquez sur le bouton Exporter dans l’interface du logiciel dans la « fenêtre d’acquisition ND ». Une fiche technique Excel s’ouvre. Enregistrez à l’emplacement souhaité.</li>
</ol>7. Analyse des données
<ol><li>Pour chaque retour sur investissement, créez une fluorescence de base moyenne à partir des 90 à 100 premières secondes.</li>
	<li>Exprimez la fluorescence calculée pour chaque retour sur investissement sous forme de pourcentage de l’arrière-plan pour ce retour sur investissement.</li>
	<li>Créez une moyenne linéaire de tous les ROI et tracez le résultat sous la forme d’un graphique linéaire. Cela crée une moyenne de tous les retours sur investissement en fonction du temps.</li>
	<li>À l’aide de la fonction d’ajustement linéaire, sélectionnez le taux initial de diminution de la fluorescence après le lavage avec la solution de Ringer. La valeur de pente de l’équation est corrélée avec le taux de transport.</li>
</ol>

Étude du mécanisme de transport du zinc dans les cellules de mammifères avec le dosage de FluoZin-3

<ol>
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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

La méthode décrite ci-dessus permet de mesurer directement la concentration intracellulaire de zinc avec une haute résolution temporelle. Comparée à d’autres méthodes, cette méthode impliquant la surveillance des changements dans le Zn2+ intracellulaire peut réduire considérablement le bruit de fond. De plus, la sélectivité du colorant pour le zinc élimine les interactions croisées potentielles avec d’autres cations métalliques18,19. ...

Le zinc est un oligo-élément essentiel dans le milieu cellulaire. Il incorpore un tiers de toutes les protéines et est impliqué dans divers processus cellulaires, tels que la catalyse1, la transcription2 et les motifs structurels3. Cependant, bien qu’elles soient inertes en matière d’oxydoréduction, des concentrations élevées de zinc sont toxiques pour la cellule, c’est pourquoi aucun organisme mammifère n’a survécu sans la présence de mécanismes régulant l’homéostasie du zinc. Chez les mammifères, trois mécanismes sont responsables de ce processus : (1) les métallothionéines, qui sont des protéines cytosoliques riches en cystéine qui se lient au zinc à haute affinité, empêchant ainsi l’excès de zinc cytosolique libre4 ; (2) les protéines de type Zrt/Irt (ZIPs), qui sont des transporteurs de zinc responsables de l’afflux de zinc dans le cytosol à travers la membrane plasmique ou à partir d’organites intracellulaires 4,5,6,7,8 ; et (3) les ZnT, qui sont un sous-ensemble de mammifères de la famille des facilitateurs de diffusion cationique (CDF) omniprésents et sont des transporteurs de zinc, car ils extrudent le zinc du cytosol à travers la membrane plasmique ou dans les organites intracellulaires 4,5,6,7,8,9. En raison de l’importance du zinc pour le métabolisme cellulaire, il est essentiel de comprendre la dynamique cellulaire du zinc.
Les méthodes précédentes d’évaluation de la dynamique du zinc reposaient sur l’évaluation des niveaux d’expression de l’ARNm dans différentes conditions de zinc en les corrélant avec les mesures cellulaires du zinc de tissus ou de cellules fixes10,11,12. Ces méthodes comprennent la détection chimique et la coloration immunohistochimique. Cependant, ces méthodes ne donnent que des mesures indirectes et, par conséquent, ne déterminent qu’une corrélation hors ligne entre la concentration intracellulaire de zinc et l’expression des transporteurs de zinc. Par conséquent, ces méthodes ne peuvent pas déduire de paramètres nécessitant une résolution temporelle élevée.
Une mesure plus directe du transport du Zn2+ utilise des isotopes radioactifs du zinc13. Cette méthode s’appuie sur la mesure du Zn2+ radiomarqué pour suivre le transport du zinc et sa cinétique. Cependant, en raison de l’importance du zinc pour l’homéostasie cellulaire, de multiples processus cellulaires régulent la concentration intracellulaire de zinc. Parmi ceux-ci figurent la liaison extracellulaire et plusieurs systèmes de transport qui fonctionnent de concert pour maintenir un contrôle étroit des niveaux intracellulaires de Zn2+ . La combinaison de ces processus crée un bruit de fond considérable, ce qui rend difficile le test des différentes fonctions de transport liées au zinc.
Cet article présente une méthode permettant de surveiller directement la vitesse de transport du zinc en mesurant la concentration intracellulaire de zinc libre à l’aide d’un colorant fluorescent spécifique au zinc, le FluoZin-3. Le colorant a une spécificité élevée pour le Zn2+ et peu d’interférences avec d’autres cations divalents, tels que le calcium. De plus, sous sa forme d’ester, il pénètre dans les cellules par diffusion non ionique et est ensuite piégé en raison de l’activité de la di-estérase intracellulaire. Ainsi, sa fluorescence est principalement corrélée à la concentration de zinc cytosolique libre. Ces expériences ont été menées pour étudier la relation structure-fonction du transporteur de zinc 1 (ZnT1), un membre de la famille ZnT.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm plate</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 mm coverslips</td>
			<td>Superior Marienfeld</td>
			<td>111530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 mm cover slides</td>
			<td>Superior Marienfeld</td>
			<td>101050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plate</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>bioWorld</td>
			<td>22070008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride anhydrous, granular</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>Concentration in Ringer solution: 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Glentham Life Science</td>
			<td>GC6947</td>
			<td>Concentration in Ringer solution: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dubelco&#8217;s Modified Eagle Media (DMEM)&#160;</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TI-DH</td>
			<td>Discontinued. Replaced by Eclipse Ti2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30088.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tweezers</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-55-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluozin-3AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F24195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Penicillin-Streptomycin 100x solution</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SV30010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED illumination system</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>pE-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05833</td>
			<td>Concentration in Ringer solution: 0.8 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N[2-Hydroxyethyl]piperazine-N&#39;-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES)</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>HEPES10</td>
			<td>Concentration in Ringer solution: 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neo 5.5 sCMOS camera</td>
			<td>ANDOR</td>
			<td>DC-152Q-FI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>AR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic acid F-127</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>540025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottasium chloride</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>163823</td>
			<td>Concentration in Ringer solution: 5.4 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrithione</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3261</td>
			<td>Concentration in Ringer zinc solution: 7 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Grease Kit</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>W4 64-0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>190305</td>
			<td>Concentration in Ringer solution: 120 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Concentration in Ringer zinc solution: 7 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>31665</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing mammalian zinc transporters using an in vitro zinc transport assay

Les métaux de transition tels que les ions Zn2+ doivent être étroitement réglementés en raison de leur toxicité cellulaire. Auparavant, l’activité des transporteurs de Zn 2+ était mesurée indirectement en déterminant le niveau d’expression du transporteur sous différentes concentrations de Zn2+. Cela a été fait en utilisant l’immunohistochimie, en mesurant l’ARNm dans les tissus ou en déterminant les niveaux cellulaires de Zn2+. Avec le développement des capteurs intracellulaires de Zn 2+, les activités des transporteurs de zinc sont actuellement principalement déterminées en corrélant les changements dans le Zn 2+ intracellulaire, détectés à l’aide de sondes fluorescentes, avec l’expression des transporteurs de Zn2+. Cependant, même aujourd’hui, seuls quelques laboratoires surveillent les changements dynamiques du Zn2+ intracellulaire et l’utilisent pour mesurer directement l’activité des transporteurs de zinc. Une partie du problème est que sur les 10 transporteurs de zinc de la famille ZnT, à l’exception du ZnT10 (transport du manganèse), seul le transporteur de zinc 1 (ZnT1) est localisé à la membrane plasmique. Par conséquent, il est difficile d’établir un lien entre l’activité de transport et les changements de la concentration intracellulaire de Zn2+. Cet article décrit un moyen direct de déterminer la cinétique de transport du zinc à l’aide d’un test basé sur un colorant fluorescent spécifique au zinc, FluoZin-3. Ce colorant est chargé dans les cellules de mammifères sous sa forme d’ester, puis piégé dans le cytosol en raison de l’activité cellulaire de la di-estérase. Les cellules sont chargées en Zn 2+ en utilisant l’ionophore pyrithione Zn2+. L’activité de ZnT1 est évaluée à partir de la partie linéaire de la réduction de la fluorescence après le lessivage cellulaire. La fluorescence mesurée à une excitation de 470 nm et à une émission de 520 nm est proportionnelle au Zn2+ intracellulaire libre. La sélection des cellules exprimant ZnT1 marquées avec le fluorophore mCherry permet de ne surveiller que les cellules exprimant le transporteur. Ce test est utilisé pour étudier la contribution de différents domaines de la protéine ZnT1 au mécanisme de transport de la ZnT1 humaine, une protéine transmembranaire eucaryote qui extrude l’excès de zinc de la cellule.

Zinc is an essential trace element in the cellular milieu. It incorporates one-third of all proteins and is involved in various cellular processes, such as catalysis1, transcription2, and structural motifs3. However, despite being redox-inert, high zinc concentrations are toxic to the cell, which is why no mammalian organism has survived without the presence of mechanisms regulating zinc homeostasis. In mammals, three mechanisms are responsible for this process: (1) metallothioneins, which are cytosolic cysteine-rich proteins that bind zinc at a high affinity, thus preventing excess free cytosolic zinc4; (2) Zrt/Irt-like proteins (ZIPs), which are zinc transporters responsible for zinc influx into the cytosol through the plasma membrane or from intracellular organelles4,5,6,7,8; and (3) ZnTs, which are a mammalian subset of the ubiquitous cation diffusion facilitator (CDF) family and are zinc transporters, as they extrude zinc from the cytosol across the plasma membrane or into the intracellular organelles4,5,6,7,8,9. Due to the importance of zinc to cellular metabolism, it is vital to understand cellular zinc dynamics.
Previous methods to assess zinc dynamics depended on assessing the expression levels of mRNA under different zinc conditions by correlating them with cellular zinc measurements of fixed tissues or cells10,11,12. These methods include chemical detection and immunohistochemistry staining. However, these methods yield only indirect measures and, thus, determine only an offline correlation between intracellular zinc concentration and the expression of zinc transporters. Consequently, these methods cannot infer any parameters requiring high temporal resolution.
A more direct measurement of Zn2+ transport uses radioactive isotopes of zinc13. This method relies on the measurement of radiolabeled Zn2+ to monitor zinc transport and its kinetics. However, due to the importance of zinc to cellular homeostasis, multiple cellular processes regulate intracellular zinc concentration. Among these are extracellular binding and several transport systems that work in concert to maintain tight control of intracellular Zn2+ levels. The combination of these processes creates considerable background noise, which makes it difficult to test individual zinc-related transport functions.
This article demonstrates a method to directly monitor the zinc transport rate by measuring the intracellular free zinc concentration using a zinc-specific fluorescent dye, FluoZin-3. The dye has high specificity for Zn2+ and little interference from other divalent cations, such as calcium. In addition, in its ester form, it enters the cells by nonionic diffusion and is then trapped due to the activity of intracellular di-esterase. Thus, its fluorescence is correlated primarily with the free cytosolic zinc concentration. These experiments were conducted to study the structure-function relationship of zinc transporter 1 (ZnT1), a member of the ZnT family.

Pleins feux sur l’auteur : Explorer la régulation cellulaire du zinc grâce à la fonctionnalité ZnT1 

Caractérisation des transporteurs de zinc chez les mammifères à l’aide d’un test in vitro de transport du zinc

My research focuses on the structure-function relationship of mammalian zinc transporters, with special emphasis on the regulation mechanism. Due to the importance of zinc ion to cellular function, it is challenging to obtain accurate measurement of cellular zinc dynamics. Our protocol addresses the low signal-to-noise ratio and low temporal resolution of zinc dynamics.This method allows testing of zinc influx across the cell membrane, with high temporal resolution and considerably less background noise and cross-interactions by other divalent cations. We found that the unstructured extension of the mammalian transporter ZnT1 one C-terminal domain is not involved in the zinc transport function. This allows researchers to focus on other domains of the ZnT1 protein for zinc transport regulation.

ZnT1 est un transporteur de zinc de mammifère situé sur la membrane plasmique cellulaire13. C’est un membre de la famille des protéines facilitatrices de diffusion cationique (CDF) qui extrudent le zinc du cytosol vers le millieu14 extracellulaire. ZnT1 a une architecture à deux domaines : le domaine transmembranaire, qui transporte les ions à travers la membrane, et un domaine C-terminal14. Contrairement à d’autres protéines CDF connues, ...

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Le transport du zinc s’est avéré difficile à mesurer en raison des faibles liens de causalité avec la fonction des protéines et de la faible résolution temporelle. Ce protocole décrit une méthode de surveillance, avec une haute résolution temporelle, de l’extrusion de Zn 2+ à partir de cellules vivantes en utilisant un colorant fluorescent sensible au Zn 2+, fournissant ainsi une mesure directe de l’efflux de Zn2+.

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...

Mes recherches portent sur la relation structure-fonction des transporteurs de zinc chez les mammifères, avec un accent particulier sur le mécanisme de régulation. En raison de l’importance de l’ion zinc pour la fonction cellulaire, il est difficile d’obtenir une mesure précise de la dynamique cellulaire du zinc. Notre protocole tient compte du faible rapport signal/bruit et de la faible résolution temporelle de la dynamique du zinc.Cette méthode permet de tester l’afflux de zinc à travers la membrane cellulaire, avec une résolution temporelle élevée et beaucoup moins de bruit de fond et d’interactions croisées par d’autres cations divalents. Nous avons constaté que l’extension non structurée du transporteur mammifère ZnT1 d’un domaine C-terminal n’est pas impliquée dans la fonction de transport du zinc. Cela permet aux chercheurs de se concentrer sur d’autres domaines de la protéine ZnT1 pour la régulation du transport du zinc.

characterizing-mammalian-zinc-transporters-using-an-vitro-zinc

Research

JoVE Journal

Biology

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

793 vues.  Ben-Gurion University. Mes recherches portent sur la relation structure-fonction des transporteurs de zinc chez les mammifères, avec un accent particulier sur le mécanisme de régulation. En raison de l’importance de l’ion zinc pour la fonction cellulaire, il est difficile d’obtenir une mesure précise de la dynamique cellulaire du zinc. Notre protocole tient compte du faible rapport signal/bruit et de la faible résolution temporelle de la dynamique du zinc.Cette méthode permet de tester l’afflux...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Explorer la régulation cellulaire du zinc grâce à la fonctionnalité ZnT1 

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured indirectly by determining the expression level of the transporter under different concentrations of Zn2+. This was done by utilizing immunohistochemistry, measuring mRNA in the tissue, or determining the cellular Zn2+ levels. With the development of intracellular Zn2+ sensors, the activities of zinc transporters are currently primarily determined by correlating changes in intracellular Zn2+, detected using fluorescent probes, with the expression of the Zn2+ transporters. However, even today, only a few labs monitor dynamic changes in intracellular Zn2+ and use it to measure the activity of zinc transporters directly. Part of the problem is that out of the 10 zinc transporters of the ZnT family, except for ZnT10 (transports manganese), only zinc transporter 1 (ZnT1) is localized at the plasma membrane. Therefore, linking the transport activity to changes in the intracellular Zn2+ concentration is hard. This article describes a direct way to determine the zinc transport kinetics using an assay based on a zinc-specific fluorescent dye, FluoZin-3. This dye is loaded into mammalian cells in its ester form and then trapped in the cytosol due to cellular di-esterase activity. The cells are loaded with Zn2+ by utilizing the Zn2+ ionophore pyrithione. The ZnT1 activity is assessed from the linear part of the reduction in fluorescence following the cell washout. The fluorescence measured at an excitation of 470 nm and emission of 520 nm is proportional to the free intracellular Zn2+. Selecting the cells expressing ZnT1 tagged with the mCherry fluorophore allows for monitoring only the cells expressing the transporter. This assay is used to investigate the contribution of different domains of ZnT1 protein to the transport mechanism of human ZnT1, a eukaryotic transmembrane protein that extrudes excess zinc from the cell.

Zinc transport has proven challenging to measure due to the weak causal links to protein function and the low temporal resolution. This protocol describes a method for monitoring, with high temporal resolution, Zn2+ extrusion from living cells by utilizing a Zn2+ sensitive fluorescent dye, thus providing a direct measure of Zn2+ efflux.

Recherche

Biologie

Zinc-Specific Staining of Transfected HEK293T Cells

Begin by analyzing transfected HEK293T cells using an inverted fluorescence microscope. Once the cells are focused using bright-field light, switch to fluorescent mCherry excitation wavelength of 587 nanometers and emission wavelengths of 610 nanometers. After turning off the bright-field light, check for the fluorescence of the cells to confirm the expression of ZnT1 mCherry.To prepare dye-loading solution, take four microliters of zinc-specific fluorescent dye solution. Then add four microliters of 10%pluronic acid. Mix the solution by pipetting up and down, and transfer it to a 1.5-milliliter tube.Add 750 microliters of washing solution into the prepared solution and vortex the tube vigorously. Again, add 750 microliters of wash solution. Once vortexed, add 750 microliters of this solution into two wells of a new six-well culture plate and cover it with aluminum foil.Using tweezers, transfer a 13-millimeter cover slip from the previously cultured HEK293T cell plate into a six-well plate. After covering the plate with foil, gently shake it for 15 to 20 minutes and replace the dye-loading solution with the prepared washing solution. Once the plate is covered, shake it again for 20 minutes.

Coloration spécifique au zinc des cellules HEK293T transfectées

Sample Preparation and Fluorescence Measurement of Stained Transfected HEK293T Cells

To begin, turn on the microscope, light source, camera, and suction system. For washing the perfusion system, use Ringer's solution in the first chamber and Ringer's zinc solution supplemented with pyrithione in the second chamber. After closing the tap, fill the chambers with the same solutions.To begin sample preparation, place the perfusion chamber with the narrow side of the groove facing up and apply a sealing silicone around the groove. Then, using a fine tweezer, transfer a 13-millimeter coverslip from the washing solution on top of the groove with cells facing down. Place a 22-millimeter coverslip on top of the 13-millimeter coverslip and tighten it using the tweezer, taking care not to crack the coverslips.Flip the chamber and press it to release the liquids. Then, fill the groove with 100 microliters of Ringer's washing solution and press again, ensuring no leakage. Mount and secure the perfusion chamber onto the platform.Then, attach the perfusion and suction tubes for perfusion over the cells in the groove. Change the perfusion rate to approximately two milliliters per minute and turn on Ringer's solution perfusion. For measurements, open the imaging software.Set the microscope magnification to 10X using the left side button of the microscope. After choosing Live View, use the joystick to move the platform and focus on the cells in the groove. Select the appropriate wavelength for mCherry.Once the cells are focused, move the platform for the selection of appropriate cell patches. Select the Draw ROIs dropdown menu. Choose Draw Circular ROIs and draw ROIs on cell clusters with the mCherry-expressing cells.Create new ROIs beyond the first by holding down the Shift button and then by pressing and dragging the existing ROIs. Select Draw Square Background ROI from the dropdown menu and adjust the location and size of the background ROI where cells are not present. After ensuring the absence of cells in the background ROI, go to the ND Acquisition tab.Select the Wavelength subtab and mark its checkbox. Ensure that the checkbox for GFP wavelength is also marked. Click on the Time subtab and define the measurement interval as every five seconds and duration as 30 minutes.On the microscope panel, press the On to enable the Perfect Focus System, or PFS. Under ND Acquisition, ensure PFS on is ticked. Adjust the focus and click Run now.Start baseline period measurement for 90 seconds using Ringer's solution perfusion. After 90 seconds, switch from the Ringer's solution perfusion to the Ringer's zinc solution perfusion, and click the red flag on the bottom right of the main interface panel once the fluorescence rise starts to saturate. Change back to perfusion with Ringer's solution until the experiment time expires.To export the data with baseline subtraction, press the Background Correction button and view the changes in the ND Acquisition window. Click the Export button to save the data in the desired location. An increase in fluorescence resulted from increased intracellular zinc concentration, while a decrease indicated the activity of ZnT-1 transporting zinc across the cell membrane.The wild type ZnT-1 had a smoother fluorescence curve than the mutant, relating to the variability in the cellular responses to zinc load. A box plot comparing the activities of wild-type and delta USCTD showed similar average transport rates, indicating a lack of difference between the wild type and the mutant. However, the difference in the spread may indicate a functional difference.