Commencez par polir au feu trois pipettes de pâturage à l’aide d’un bec Bunsen, en créant des diamètres décroissants. Ensuite, stérilisez l’abdomen d’une mère de souris enceinte euthanasiée avec 70 % d’éthanol. Ouvrir la cavité abdominale de la synthèse pubienne à l’apophyse xiphoïde de la cage thoracique.
Maintenant, extrayez la corne utérine de la cavité abdominale et placez-la dans une plaque de 100 millimètres remplie d’une solution HBSS glacée. Extraire et séparer tous les embryons de l’utérus lavé à l’aide d’une pince fine. Décapitalisez rapidement les embryons de souris extraits et placez les têtes dans une boîte de Pétri de 60 millimètres remplie de HBSS.
Placez une paire de pinces fines dans la cavité oculaire pour maintenir le cerveau. À l’aide d’une autre paire, pelez la peau et le crâne jusqu’à ce que le cerveau soit visible. Retirez le cerveau des bulbes olfactifs du crâne et retournez-le.
Observez le cortex sur la face ventrale et l’hypothalamus sur la face dorsale. Utilisez une pince incurvée pour enlever la couche de méninges et de vaisseaux sanguins jusqu’à ce que le cerveau apparaisse blanc et clair, et séparez la zone hypothalamique du reste du cerveau. Coupez l’hypothalamus en trois à quatre petits morceaux fins et utilisez une pipette pour transférer les morceaux dans un tube de 15 millilitres.
Ensuite, remplissez le tube avec six millilitres de HBSS. Ajoutez ensuite le mélange enzymatique 1 une fois que le tissu s’est déposé et que le surnageant a été retiré. Incubez le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes, en agitant toutes les cinq minutes pour remettre le tissu en suspension.
Maintenant, ajoutez 30 microlitres d’Enzyme Mix 2 et dissociez le tissu en pipetant de haut en bas 10 fois avec une pipette de pâturage de grand diamètre. Après une incubation supplémentaire de 10 minutes, ajoutez les 15 microlitres restants d’Enzyme Mix 2. À l’aide de deux pipettes polies au feu de diamètre décroissant, pipetez le tissu 10 fois.
Ajouter immédiatement 10 millilitres de HBSS avec 0,5 % de BSA dans le tube. Centrifugez ensuite le tube à 300 G pendant 10 minutes à température ambiante. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre d’HBSS avec 0,5 % de BSA.
