Commencez par centrifuger la suspension de cellules neuronales pures murines à 300 G pendant huit minutes. Aspirer doucement le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 80 microlitres d’HBSS avec une solution à 0,5 BSA. Après avoir ajouté l’anticorps spécifique, incubez les tubes à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.
Lavez l’excès d’anticorps avec une solution HBSS-BSA et une centrifugeuse. Ajouter 20 microlitres de microbilles d’antibiotine à la pastille, remise en suspension dans HBSS-BSA. Incuber le tube à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.
Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de HBSS avec une solution de BSA à 0,5 % pour chaque 10 aux sept cellules. Rincez la colonne avec 0,5 millilitre d’HBSS avec une solution BSA à 0,5 %. Une fois que l’égouttement s’arrête, placez un tube de 15 millilitres sous la colonne et faites-y passer 0,5 millilitre de suspension cellulaire.
Recueillir l’éluat contenant des cellules neuronales non spécifiques, puis nettoyer la colonne avec trois lavages de 0,5 millilitre de HBSS avec 0,5% BSA. Retirez maintenant la colonne de l’aimant et placez-la dans un nouveau tube de 15 millilitres. Ajoutez un millilitre d’HBSS avec 0,5 % de BSA et utilisez le piston pour rincer les cellules ciblées.
Après centrifugation et aspiration surnageante, remettre la pastille en suspension dans 0,5 millilitre de milieu de placage. Comptez les cellules dans une chambre de comptage Neubauer sous un microscope à fond clair. Plaquer les cellules ciblées en tant que témoin positif et les cellules non spécifiques en tant que témoin négatif dans la plaque à 24 puits préparée.
Incuber à 37 degrés Celsius pendant 12 heures. Les neurones LepR-positifs ont commencé à former des neurites après 48 heures. À DIV4, les extensions axonales ont montré des progrès, tandis que les processus dendritiques ont commencé à apparaître.
À DIV6, les neurones étaient suffisamment développés. Des études immunofluorescentes ont montré qu’aucune cellule gliale ou autre cellule non neuronale n’a été observée. La nature neuronale des cellules a été confirmée par la coloration de la protéine 2 associée aux microtubules.
À DIV10, 30 % des cellules LepR positives exprimaient le POMC. La connectivité et la fonctionnalité synaptiques ont été observées dans des cultures générales contenant des populations neuronales hypothalmiques hétérogènes.
