Commencez par centrifuger la suspension de cellules cérébrales isolées à 300G pendant huit minutes. Remettre la pastille en suspension dans 80 microlitres d’HBSS avec une solution à 0,5 % de BSA. Ajouter 20 microlitres de cocktail d’anticorps à biotine pour cellules non neuronales et incuber.
Lavez les cellules avec deux millilitres d’HBSS à 0,5 % de BSA. Ensuite, remettez en suspension la pastille de centrifugeuse dans 80 microlitres d’HBSS avec 0,5 % de BSA. Ajoutez maintenant 20 microlitres de microbilles anti-biotine et pipetez pour bien mélanger.
Après l’incubation à froid, ajoutez 0,5 millilitre de solution HBSS BSA. Installez le support avant de rincer la colonne avec 0,5 millilitre d’HBSS à 0,5 % de BSA. Ensuite, placez un tube de 15 millilitres sous la colonne et passez-y 0,5 millilitre de suspension cellulaire.
Effectuez trois lavages avec 0,5 millilitre de HBSS avec une solution à 0,5 % de BSA pour capturer les cellules neuronales résiduelles. Retirez la colonne de l’aimant et placez-la à l’intérieur d’un nouveau tube de 15 millilitres. Ajoutez un millilitre d’HBSS avec 0,5 % de BSA et utilisez le piston pour collecter des cellules non neuronales marquées magnétiquement.
Après la centrifugation des cellules, remettre les cellules en suspension dans un millilitre d’HBSS avec une solution de BSA à 0,5 %. Comptez les cellules dans une chambre de comptage Neubauer sous un microscope à fond clair. Les neurones positifs LepR ont commencé à former des neurites après 48 heures.
À DIV4, les extensions axonales ont montré des progrès tandis que les processus dendritiques ont commencé à apparaître. À DIV6, les neurones étaient suffisamment développés. Des études immunofluorescentes ont montré qu’aucune cellule gliale ou autre cellule non neuronale n’a été observée.
La nature neuronale des cellules a été confirmée par la coloration de la protéine 2 associée aux microtubules. À DIV10, 30 % des cellules LepR positives exprimaient le POMC. La connectivité et la fonctionnalité synaptiques ont été observées dans des cultures générales contenant des populations neuronales hypothalamiques hétérogènes.
