Pour l’infection lentivirale, plaquer les cellules cibles MPNST trypsinisées après les avoir comptées, en maintenant 2,5 millions de cellules par boîte de 15 centimètres. Transduit les cellules avec le virus décongelé à une multiplicité d’infection de 0,5, en présence de cinq microgrammes par millilitre de polymère cationique. Trypsiniser les cellules trois jours après l’ajout de puromycine.
Centrifuger la moitié de la population cellulaire à 200 G pendant cinq minutes dans une centrifugeuse de table. Après avoir replaqué l’autre moitié de la population cellulaire, cultivez-les pour environ sept doublements de population avant de les récolter et de les centrifuger comme démontré précédemment. Divisez la pastille de cellules remise en suspension correspondant au temps souhaité dans deux tubes de polyméthylpentène de 15 millilitres.
Ajouter 500 microlitres de SDS à 10% par tube. Mélanger et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Placez les tubes dans un dispositif de cisaillement de l’ADN pour soniser l’ADN.
Suite à l’ajout de phénol et de chloroforme. Bien mélanger en tourbillonnant vigoureusement à la vitesse maximale possible pendant 45 à 60 secondes. Transférez trois millilitres de la phase supérieure transparente résultante de chaque tube dans un autre tube frais de 15 millilitres.
Ajouter 0,5 millilitre d’acétate de sodium à trois molaires et quatre millilitres d’isopropanol et bien mélanger. Après avoir centrifugé les tubes pendant 30 minutes à 7, 200 G et 20 degrés Celsius et éliminé le surnageant, ajoutez 0,5 millilitre d’éthanol à 70 % à la pastille et délogez-la en pipetant de haut en bas. Combinez les pastilles remises en suspension des deux tubes dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre.
Effectuez les réactions PCR en utilisant les conditions affichées à l’écran. Après la deuxième réaction de PCR, combinez les quatre échantillons dans un tube de micro-centrifugation. Et ajoutez-y 80 microlitres de colorant de charge 6X.
Visualisez le gel et confirmez une bande à environ 250 paires de bases. Des cellules MPNST humaines transduites avec un témoin non ciblé et un lentivirus, exprimant quatre ARN d’épingle à cheveux courts Bcl-6 différents, ont révélé que plusieurs des ARN en épingle à cheveux courts Bcl-6 réduisaient considérablement le nombre de cellules. Le transfert immunologique a montré que le degré de diminution du nombre de cellules était corrélé au degré d’inactivation de Bcl-6.
