Pour mettre en place le nouveau système de culture d’écoulement multicanaux sans pompe, après avoir assemblé le module de réservoir de média ou MRM, insérez-y les assemblages de tubes et placez le MRM dans le réchauffeur. Après avoir fixé l’appareil de chauffage en place, procédez à l’insertion des assemblages de chambre à tissus ou TCA dans le module de chambre de perfusion ou PCM. À l’aide de l’outil d’insertion TCA, insérez chacun des huit TCA un par un dans les trous PCM.
Assurez-vous d’appuyer fermement sur l’adaptateur avec l’outil jusqu’à ce que le haut du manchon de tubulure autour de chaque chambre touche la surface circonscrivant les trous dans le PCM. Mettez de côté le PCM partiellement assemblé avec l’entretoise PCM et six vis. 30 minutes après l’assemblage de l’enceinte et une fois que le MRM a atteint la température souhaitée, à l’aide d’une pipette de 50 millilitres, transférez le perfusat prééquilibré dans l’insert MRM préchauffé en dispersant doucement le liquide sur les côtés.
Ensuite, pour placer le PCM sur le MRM, insérez les tubes de résistance TCA émanant du bas du PCM dans les inserts MRM, quatre de chaque côté du séparateur MRM. Orientez le module de manière à ce que les chambres tissulaires reposent contre le détecteur d’oxygène une fois positionné. Fixez le PCM à l’entretoise de support à l’aide de six vis et du tournevis électrique.
Fixez ensuite les TCA à l’intérieur des ailettes de support PCM à l’aide de la bande élastique fournie, en l’étirant autour des ailettes au niveau des joints en caoutchouc. Positionnez le détecteur d’oxygène sur le support du détecteur en veillant à ce que sa face repose contre les ailettes PCM. Alignez les paires de photodétecteurs LED avec le colorant sensible à l’oxygène dans les chambres tissulaires en desserrant les vis placées sur le côté du support du détecteur et en ajustant les guides latéraux du détecteur si nécessaire.
Enfin, placez le couvercle sur le dessus du boîtier. Pour charger le tissu dans les chambres, attendez que le niveau du milieu soit à 0,5 pouce du haut. Pour charger la rétine prélevée ou la sclérotique choroïde de l’EPR, à l’aide d’une pince à pointe fine, placez doucement la rétine sans la replier dans chaque chambre.
Pendant ce temps, utilisez une lingette pour éviter que le liquide de la chambre à tissus ne coule sur le capteur d’oxygène. Laissez le tissu s’enfoncer vers et sur le FRET. Pour charger les cellules RPE sur les membranes Transwell, après avoir fait passer les cellules préparées avec 0,25 % d’EDTA de trypsine, ensemencez-les sur des filtres en polyéthylène téréphtalate gravés sur piste ayant une taille de pores de 0,4 millimètre.
Le jour de l’expérience, coupez les membranes en trois bandes de largeur égale et chargez-les dans les chambres tissulaires à l’aide d’une pince. Le taux de consommation d’oxygène, ou OCR, de la rétine était constant pendant la période d’injection des composés testés, ce qui indique une santé et une fonction stables du tissu et soutient la validité de la méthode. Conformément aux données obtenues à l’aide des méthodes de perfusion conventionnelles pour la rétine et la sclérotique choroïde de l’EPR, l’OCR a diminué en réponse à l’oligomycine et a augmenté en réponse à la FCCP.
Les changements observés dans le taux de production de lactate ou LPR étaient inverses de ceux observés pour l’OCR. Les cellules de l’EPR, qui n’ont pas été analysées auparavant avec des systèmes d’écoulement, ont réagi de la même manière à la sclérotique choroïde de l’EPR en utilisant cette méthode.
