Constructing the 3D Human-Stem-Cell-Derived In Vitro Blood Brain Barrier

Assembler la barrière hémato-encéphalique dérivée de cellules souches pluripotentes humaines, ou iBBB, à l’aide des cellules endothéliales dissociées, des parasites et des astrocytes, Combiner les trois types de cellules dans un tube conique tout en incluant 10% de plus que le nombre calculé de cellules pour tenir compte des erreurs de pipetage. Essorez le mélange cellulaire à 300 g pendant trois minutes. Aspirer le surnageant, en laissant la pastille cellulaire avec environ 50 microlitres de milieu.

À l’aide d’une pipette P200, remettre délicatement en suspension la pastille cellulaire dans le milieu résiduel pour créer une suspension unicellulaire. Placez le tube contenant la boue cellulaire résultante sur de la glace et ajoutez-y une quantité suffisante de matrice de membrane basale GF réduite selon le nombre souhaité d’iBBB. Mélangez les cellules de manière homogène sans introduire de bulles d’air.

Pipeter 50 microlitres du mélange de matrice cellulaire résultant dans un puits d’une boîte de culture à fond de verre à 48 puits ou 96 puits et le répartir uniformément dans le fond de la boîte. Incuber la boîte à 37 degrés Celsius pendant 30 à 40 minutes pour polymériser la matrice tout en encapsulant les cellules. Enfin, ajoutez 500 microlitres de milieu astrocytaire supplémenté dans le puits et maintenez les iBBB en culture.

Pour une plaque de 96 puits, ajoutez 100 à 150 microlitres de milieu dans le puits jusqu’à ce qu’ils soient suffisamment développés pour les analyses en aval, ce qui prend généralement deux semaines. L’iBBB correctement formé est apparu sous la forme d’un disque translucide unique solidifié sous un microscope à fond clair. Après 24 heures, des cellules individuelles uniformément réparties ont été identifiées.

Au bout de deux semaines, des structures plus distinctes, bien que difficiles à définir, étaient visibles.