Pour commencer, utilisez des ciseaux pour découper un petit morceau de papier pour lentilles et placez-le dans une boîte de Pétri. Ensuite, versez le formol contenant le cerveau et la colonne vertébrale fixes isolés d’une souris dans un entonnoir tapissé de papier filtre. Transférez le cerveau et la colonne vertébrale dans une boîte de Pétri vide.
Utilisez un scalpel pour diviser le cerveau en six morceaux coronaux. À l’aide d’une pince, transférez les échantillons de cerveau sur la moitié du papier de lentille dans la boîte de Pétri. Coupez la moelle épinière en trois morceaux à l’aide du scalpel, puis coupez le morceau de colonne vertébrale sacrée à l’extrémité caudale jusqu’à ce que la moelle épinière devienne visible.
Soulevez la colonne thoracique avec la main non dominante. Prenez la pince Adson avec les dents bien fermées dans la main dominante et poussez doucement l’extrémité dans la plus petite ouverture de la colonne vertébrale avec un léger mouvement de torsion. Ensuite, à l’aide d’une pince, tirez doucement la moelle épinière émergente hors de la colonne, placez le morceau de cordon dans la boîte de Pétri contenant le papier pour lentilles.
À l’aide d’un scalpel, divisez trois morceaux de moelle épinière en morceaux de section transversale plus petits. Disposez ces morceaux sur la même moitié du papier de lentille contenant les morceaux de cerveau. Pliez le papier pour lentilles pour prendre en sandwich les morceaux de tissu et placez-le dans une cassette étiquetée.
Transférez la cassette dans un bocal contenant du formol. Après l’incubation, transférez la cassette du récipient de l’échantillon dans le premier bain de formol dans le préparateur automatique de tissus et faites fonctionner le processeur pendant la nuit. Le lendemain, retirez les cassettes du préparateur et transférez-les dans la chambre de maintien chaude de la station d’enrobage de paraffine, versez la cire de paraffine pour recouvrir le fond du moule.
À l’aide d’une pince fine, placez des morceaux de section transversale du cerveau coronaire et de la moelle épinière dans la paraffine au fond du moule. Transférez le moule sur la surface de refroidissement pendant plusieurs secondes pour fixer le cerveau et les échantillons en place. Ramenez le moule sur la surface chauffée et remplissez-le jusqu’en haut de paraffine chaude.
Placez le couvercle de la cassette étiqueté avec l’identification de l’échantillon sur le moule. Versez de la paraffine sur le couvercle de la cassette. Transférez le moule dans la station de refroidissement pour permettre à la cire de prendre.
Une fois que les blocs sont complètement refroidis, fixez-les sur un microtome rotatif. Coupez les blocs et coupez des sections de cinq micromètres de chaque bloc de paraffine. Déplacez le ruban de paraffine dans un bain-marie à 42 degrés Celsius.
Récupérez la section du bain-marie sur une lame étiquetée. Placez les lames dans une grille en plastique et faites cuire les sections pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans un four sec. Après la numérisation, ouvrez l’image J, puis faites glisser et déposez l’image tiff de la section pour analyse.
Observez la section de la moelle épinière dans quatre quadrants et notez la présence de lésions de démyélinisation dans chaque quadrant. Cette section a un score de quatre, car il y a des lésions dans les quatre quadrants. Cette section obtient un pointage de un, car les lésions ne se trouvent que dans un quadrant.
La coloration CD45 indique la présence de leucocytes dans les lésions. Les nouvelles lésions contiennent beaucoup de cellules CD45 par rapport aux anciennes. En revanche, les nouvelles lésions peuvent contenir moins d’axones positifs SMI-32 que les lésions plus anciennes.
Les souris du groupe de type sauvage ont développé une EAE sévère avec paralysie complète. Alors que le groupe OGR1-KO a développé une maladie bénigne. Cette différence de score clinique correspondait à des variations dans les lésions de démyélinisation sous-méningée, en pourcentage de la zone de myéline colorée dans la moelle épinière, en outre, le pourcentage de fraction de myéline différait également significativement entre OGR1 et les souris de type sauvage et il était corrélé avec le score EAE cumulé.
Dans l’EAE, l’inflammation dans le cerveau est principalement localisée dans le cervelet et le tronc cérébral. D’autres zones d’inflammation peuvent être évidentes dans le cerveau, y compris dans les méninges, près des ventricules et dans d’autres pistes de substance blanche telles que le nerf optique et le corps calleux. La lumière des neurofilaments sériques mesurée à l’aide d’un test sur puce à petites molécules a détecté des niveaux de lumière des neurofilaments sériques plus élevés chez les souris atteintes d’EAE par rapport aux souris saines et ces niveaux élevés étaient corrélés à la densité de SMI-32 positif dans la moelle épinière.
