Pour commencer, pipetez 3,75 millilitres de milieu sérique réduit dans un tube étiqueté A et diluez le milieu avec 105 microlitres de réactif de transfection. Vortex le contenu du tube pour bien mélanger. Ensuite, ajoutez 3,75 millilitres du milieu sérique réduit dans un tube étiqueté B.Diluez les plasmides d’expression avec 90 microlitres de réactif enhancer.
Ajoutez maintenant le contenu du tube A au tube B et pipetez la solution pour bien mélanger avant l’incubation. Retirez délicatement 10 millilitres de milieu de culture cellulaire d’une plaque Phoenix eco préparée. Ajoutez ensuite tout le volume du mélange de transfection dans la plaque goutte à goutte.
Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur. Placer le milieu de récolte virale MTCM dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pour le préchauffer. Inclinez maintenant la plaque écologique Phoenix et pipetez le milieu de culture.
Ensuite, pipetez lentement 30 millilitres du milieu de prélèvement viral préchauffé dans la plaque inclinée. Remettez les cellules dans l’incubateur. Après 48 heures de transfection, récoltez le surnageant viral.
Filtrez-le à travers des filtres PVDF de 0,45 micromètre. À l’aide de l’arrière d’une seringue stérile, écraser la rate murine isolée à travers une crépine cellulaire de 70 à 100 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres. Lavez ensuite la crépine avec cinq millilitres de tampon d’isolement des lymphocytes T.
Après avoir porté le volume final des cellules à 50 millilitres, comptez les cellules avec l’hémocytomètre. Pelleter les cellules par centrifugation pendant 10 minutes à 450 G à quatre degrés Celsius ou à température ambiante. Remettez en suspension la pastille cellulaire contenant les splénocytes à l’aide du kit d’isolement des lymphocytes T recommandé.
Isolez ensuite les lymphocytes T CD3 positifs à l’aide de la sélection négative. Transférez l’isolat séparé magnétiquement dans un tube conique de 15 millilitres. Vérifiez à nouveau le nombre de cellules.
Centrifuger les lymphocytes T isolés pendant 10 minutes à 450 G à quatre degrés Celsius. Ensuite, remettez en suspension la pastille cellulaire dans un milieu d’activation MTCM. Ajoutez maintenant des billes magnétiques enrobées d’anticorps et de l’interleukine-2 à la suspension cellulaire pour activer les lymphocytes T.
Incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Au jour zéro, pré-enduire des plaques stériles non traitées à 24 puits avec 0,5 millilitre de réactif activateur de transduction de la fibronectine humaine. Conservez les assiettes à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
Le lendemain, retirez le réactif de transduction des puits. Bloquez les puits avec un volume égal de PBS stérile filtré à base de BSA pendant 30 minutes à température ambiante. Après l’incubation, retirez le BSA PBS et lavez les puits avec 0,5 à un millilitre de PBS.
Ensuite, ajoutez un millilitre de rétrovirus pur dans chaque puits pré-enrobé. Centrifuger la plaque à 2 000 G pendant 90 minutes à 32 degrés Celsius. Ajoutez ensuite un millilitre de lymphocytes T activés à chaque puits chargé sur le plan viral.
Centrifugez à nouveau les plaques à 450 G pendant 10 minutes à 32 degrés Celsius. Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le cinquième jour, remettez les cellules en suspension pour dissocier les lymphocytes T activés des billes enrobées d’anticorps.
Placez la suspension de la cellule sur un aimant pendant 30 secondes. Transférez ensuite la suspension dans un récipient de culture ex vivo. Placez les vaisseaux dans un incubateur à 37 degrés Celsius avant l’analyse par cytométrie en flux.
L’utilisation d’un kit d’isolement des lymphocytes T a permis d’obtenir des puretés des lymphocytes T inférieures à 98 % avant la transduction. Des taux d’expression reproductibles de CAR de 65 à 75 % ont été atteints. Les cultures ex vivo avec les interleukines-7 et 15 ont conduit à une post-activation de 15 fois au jour 10 à partir d’une seule rate.
La culture des lymphocytes T avec les interleukines a permis d’obtenir des fréquences comparables de lymphocytes T CD8 positifs et CD4 positifs. Après 10 jours de culture ex vivo, on a observé que les populations de cellules souches mémoires étaient préservées.
