Pour commencer, préparez des échantillons clairs de tissu rénal. Allumez ensuite le microscope confocal en activant d’abord l’alimentation du laser, puis en engageant l’interrupteur de commande confocale. Ensuite, démarrez l’ordinateur, allumez le microscope et lancez le matériel confocal.
Après avoir exécuté l’autotest, lancez le logiciel confocal. Sélectionnez l’objectif approprié. Récupérez l’échantillon du réactif R cubique et placez-le dans la boîte confocale.
Couvrez-le pour éviter que le réactif R cubique ne sèche. Déplacez l’échantillon vers le centre du champ de vision et ajustez la mise au point jusqu’à ce que l’échantillon soit net. Pour la reconstruction 3D, ajustez le plan de zoom dans une direction jusqu’à ce qu’aucune fluorescence ne soit visible, en définissant cette position comme le haut.
Ajustez ensuite le plan de zoom dans la direction opposée jusqu’à ce qu’aucune fluorescence ne soit visible, en définissant cette position comme le bas. Cliquez sur le bouton Exécuter dans le coin inférieur droit de la boîte de dialogue pour lancer l’analyse. Pour la reconstruction d’une grande image, positionnez le champ de vision au milieu de l’échantillon et définissez-le comme centre.
Choisissez un champ de vision deux par deux. Dans l’interface multifonction ND, sélectionnez la pile Z pour reconstruire des images de grande taille. Ajustez les différentes options du panneau selon vos besoins, puis appuyez sur le bouton Exécuter pour commencer la numérisation.
Collez le rein transparent à l’adaptateur de fixation de l’échantillon avec de la colle et attendez que le rein soit solidement fixé. Plongez ensuite le rein dans le bac à échantillons et glissez le bac à échantillons dans le système de microscope. Scellez la trappe.
Dans l’interface de localisation, ajustez l’échantillon à une position d’observation appropriée. Passez à l’interface d’acquisition, définissez le chemin optique. Sélectionnez le laser de 488 nanomètres.
Choisissez le filtre de faisceau lumineux de 405-488-561-640, puis réglez le bloc de filtre de séparation optique sur SBS LP 490. Sélectionnez la deuxième caméra et modifiez la pseudo-couleur en vert. Entrez le décalage Z gauche puis droit obtenu à partir du sous-menu du canal.
Sélectionnez le plus petit zoom et ajustez-le pour une clarté optique. Identifiez la limite XY et la plage Z pour l’ensemble de l’organe. Modulez ensuite l’intensité du laser et le temps d’exposition à moins de 10 millisecondes.
Lancez le processus en cliquant sur Démarrer l’expérience. Si le tissu est excessivement grand, combinez deux images ou plus avec l’assemblage d’images à l’aide du logiciel de microscopie. Ouvrez le fichier capturé et sélectionnez traitement.
Puis méthode et couture, suivis du paramètre de méthode. Cliquez sur Appliquer pour finaliser l’assemblage de l’image. Un brin fitindex injecté par voie intravasculaire a été utilisé pour marquer les glomérules.
Dans le rein dégagé, les glomérules ont pu être clairement observés à l’aide de la microscopie à feuillet de lumière ou de la microscopie confocale.
