Coloration par immunofluorescence et microscopie confocale haute résolution de cellules HeLa knock-out CENP-E médiées par CRISPR/Cas9

Pour commencer, prenez une plaque de cellules HeLa de type sauvage et de cellules HeLa mutantes CENP-E se développant sur une lamelle. Fixez les cellules avec 4% de paraformaldéhyde et une solution fixatrice PBS à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, plongez dans PBS pendant deux tours de cinq minutes chacun.

Ensuite, perméabilisez les cellules avec 0,25 % de Triton X-100 et de PBS à température ambiante pendant 10 minutes. Plongez-les dans PBS pendant deux tours de cinq minutes chacun. Procédez au blocage des cellules avec 1 % de BSA PBS avec 0,1 % de Tween 20 à température ambiante pendant une heure.

Diluer les anticorps primaires dans 1 % de BSA et de PBST et incuber les échantillons à quatre degrés Celsius pendant 12 heures. Jeter les solutions d’anticorps primaires. Ensuite, rincez les cellules trois fois pendant cinq minutes chacune avec du PBS.

Ajouter les anticorps secondaires dilués à la cellule et incuber à température ambiante pendant deux heures. Ensuite, jetez les anticorps secondaires. Ensuite, rincez les cellules avec du PBS trois fois pendant cinq minutes chacune.

Colorer les noyaux avec du DAPI à température ambiante pendant cinq minutes. Montez les diapositives avec le support de montage et scellez-les avec du vernis à ongles. Observez les images de fluorescence à l’aide d’un microscope confocal à balayage, équipé d’un grossissement de 63 fois et d’un objectif à ouverture numérique de 1,40, et enregistrez-les pour une analyse plus approfondie.

La coloration par immunofluorescence des groupes témoins et mutants CENP-E a montré que les intensités de fluorescence des protéines CENP-E étaient complètement éliminées dans les cellules du clone 1 du mutant CENP-E et significativement diminuées dans les cellules du clone 3 du mutant CENP-E. Les ratios de cellules métaphasiques présentant un désalignement chromosomique ont augmenté dans les clones 1 et 3 par rapport aux cellules témoins. Pendant ce temps, les ratios de cellules métaphasiques ont augmenté de manière significative dans les cellules clones 1 et clone 3.

De plus, le ratio de cellules interphasiques a légèrement augmenté dans les groupes clones 1 et 3 après la délétion de CENP-E, par rapport au groupe témoin. Les taux de cellules de prophase, d’anaphase et de télophase ont légèrement diminué après la délétion de CENP-E, tandis que les taux de cellules de métaphase ont augmenté après la délétion de CENP-E.