Pour commencer, ajoutez une solution de trypsine-EDTA à 0,25 % dans les cellules HeLa et incubez à 37 degrés Celsius pendant deux à trois minutes. Dissociez doucement les cellules par pipetage et ensemencez-les dans de nouvelles plaques dans un rapport de un à quatre pour le passage des cellules. Pour transfecter le plasmide dans les cellules HeLa, mélangez un microgramme de plasmide d’ARNsg PX458 validé, avec 50 microlitres de milieu sérique réduit dans le tube A.In tube B, mélangez délicatement deux microlitres de réactif de transfection et 50 microlitres de milieu sérique réduit et incubez à température ambiante pendant cinq minutes.
Ensuite, mélangez le contenu des tubes A et B et incubez à température ambiante pendant cinq minutes supplémentaires. Ajouter le mélange dans la plaque à 12 puits et incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant six heures. À la fin de l’incubation, remplacer le milieu par du milieu DMEM frais.
Après 24 ou 48 heures, évaluez l’efficacité de la transfection en examinant les cellules HeLa au microscope à fluorescence. Dissocier complètement les cellules HeLa transfectées avec de l’EDTA à 0,25 % de trypsine et incuber à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes. Ensuite, comptez les cellules à l’aide d’une chambre Neubauer ou d’un compteur de cellules automatisé.
Plaquez les cellules en trois plaques distinctes de 96 puits pour chaque population transfectée en suivant des méthodes de dilution en série. Remettez les cellules dans un incubateur humidifié pendant une à deux semaines. Pour le criblage et la validation de CENP-E Knockout basés sur le phénotype, dissocier et développer les cellules dans des plaques de 24 ou 12 puits pendant cinq à sept jours.
Criblez les cellules mutantes avec des diamètres de colonie plus petits à l’aide d’un microscope inversé avec des lentilles d’objectif à grossissement 10 fois et 20 fois. Ensuite, récoltez les cellules pour l’extraction de l’ADN en utilisant le kit d’extraction d’ADN génomique animal en colonne en suivant les instructions du fabricant et configurez les réactions en chaîne par polymérase. Placez l’ADN cible dans le vecteur pMD18-T selon les instructions des protocoles du fabricant.
Transfectez le plasmide ligaturé dans les cellules DH5-Alpha compétentes et procédez à la culture pour la sélection des clones. Pour identifier les types de CENP-E Knockout, isolez l’ADN plasmidique à l’aide d’un kit d’extraction de plasmide en suivant les directives du fabricant. Ensuite, effectuez le séquençage de Sanger pour l’ADN plasmidique de chaque colonie à l’aide d’amorces directes et inverses M13.
Ensemencez les cellules HeLa de type sauvage et les cellules HeLa mutantes CENP-E sur des lamelles de verre de 12 millimètres dans une plaque de 24 puits. Retirez le milieu DMEM complet et fixez les cellules à l’aide d’une solution de paraformaldéhyde à 4 % et de PBS à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, colorez les noyaux avec du DAPI à température ambiante pendant cinq minutes.
Observer et valider les cellules mutantes CENP-E en fonction du phénotype d’alignement des chromosomes à l’aide d’un microscope à fluorescence. Le criblage phénotypique des colonies a montré que les cellules CENP-E Knockout présentaient un désalignement chromosomique accru par rapport au groupe témoin.
