Préparation chromosomique et analyse du caryotype des cellules HeLa knock-out CENP-E médiées par CRISPR/Cas9

Pour commencer, prenez les cultures de cellules HeLa de type sauvage et mutantes CENP-E et ajoutez 300 nanomolaires de colchicine avant de les incuber pendant cinq heures. Ensuite, incubez les cellules avec 0,25 % de trypsine-EDTA à 37 degrés Celsius pendant trois minutes et rassemblez les cellules dans des tubes à centrifuger de 1,5 millilitre. Ensuite, centrifuger les cellules à 1000 G pendant cinq minutes à température ambiante, jeter les surnageants et ajouter 1,2 millilitre de solution de chlorure de potassium à 0,075 molaire.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. À la fin de l’incubation, centrifuger les cellules, jeter le surnageant et ajouter 0,2 millilitre de solution fixatrice pour le préfixe. Mélangez doucement pendant une minute, puis récupérez les granulés cellulaires comme démontré précédemment, et ajoutez 1,5 millilitre de solution fixatrice à température ambiante pendant 10 minutes.

Après avoir centrifugé les cellules et jeté le surnageant, ajoutez 0,6 millilitre de solutions fixatrices pour créer une suspension cellulaire. Déposez délicatement trois à cinq gouttelettes de suspensions cellulaires de 35 à 40 centimètres sur les lames de glace. Séchez immédiatement les lames à l’aide d’une lampe à alcool et teignez-les avec la solution de maintien à 10 % de Giemsa pendant sept minutes.

Rincer les lames à l’eau courante pendant deux minutes, puis examiner les échantillons à l’aide d’un microscope optique équipé d’un objectif Plan Fluor à ouverture numérique de 0,75 grossissement 40 fois. L’analyse du caryotype a révélé une diminution du nombre de chromosomes dans les cellules HeLa mutantes CENP-E par rapport aux cellules de type sauvage.