Réactions d’expression acellulaire en vrac avec de petites vésicules unilamellaires (SUV) pour des applications de cellules synthétiques

Pour commencer, soufflez un léger filet d’Argonne dans un flacon en verre contenant des lipides POPC tout en tournant doucement le flacon. Lorsque les lipides ont séché sous forme de film au fond du flacon, bouchonnez-le sans serrer, puis transférez-le dans un dessiccateur. Après une heure, ajoutez 0,5 millilitre d’eau déminéralisée ultrapure pour dissoudre le film lipidique.

Agitez la solution pendant deux minutes. Ensuite, faites tremper deux supports de filtre et de l’eau déminéralisée. Placez-les sur chacun des supports internes de la membrane.

Placez ensuite un filtre en polycarbonate de 100 nanomètres entre les deux supports de membrane internes, maintenus ensemble par le boîtier extérieur de l’extrudeuse et l’écrou de retenue. Placez l’installation dans le support de l’extrudeuse pour terminer la mise en place de la mini machine d’extrusion. Ensuite, chargez le mélange d’eau lipidique dans une seringue étanche au gaz d’un millilitre.

Utilisez des clips à bras oscillant pour fixer la seringue à une extrémité de la mini-extrudeuse. Insérez la deuxième seringue dans l’autre extrémité de la mini-extrudeuse, en vous assurant qu’elle est complètement enfoncée. Passez maintenant le mélange d’eau lipidique de la seringue d’origine dans la seringue vide à travers l’appareil.

Après avoir répété l’extrusion 11 fois, transférez les SUV dans un microtube de centrifugation de 1,5 millilitre. Pour assembler le protocole d’expression acellulaire, la pipette solutions un à 3 plasmides d’ADN codant pour le SFGFP soluble ou des variantes du récepteur du glutamate SFGFP, de l’ARNase murine et de la solution SUV dans un flacon. Ajoutez de l’eau déminéralisée ultrapure pour porter le volume de réaction à 20 microlitres.

Transférez la solution d’expression acellulaire dans une plaque inférieure en V conique à 96 biens. Incuber la plaque dans un lecteur de plaque à 37 degrés Celsius pendant quatre à cinq heures. Configurez le lecteur de plaques avec un gain de 100, une excitation de 485 nanomètres, une émission de 528 nanomètres, une autonomie de cinq heures et une mesure d’intervalle d’une lecture toutes les deux minutes.

Mesurez le signal GFP toutes les deux minutes pour surveiller la réaction acellulaire en temps réel. La SFGFP soluble avait l’expression la plus élevée parmi les trois protéines.