L’APL remercie la National Science Foundation (EF1935265), les National Institutes of Health (R01-EB030031 et R21-AR080363) et le Bureau de recherche de l’armée (80523-BB)

Les réactifs et l’équipement utilisés pour cette étude sont fournis dans la table des matériaux.
1. Réactions CFE en vrac en présence de petites vésicules unilamellaires (SUV)
<ol><li>Préparation du SUV REMARQUE : Cette étape doit être effectuée dans une hotte en suivant les instructions de sécurité pour travailler avec du chloroforme.<ol><li>Préparez 5 mM de VUS de 1-palmitoyl-2-oléoyl-glycéro-3-phosphocholine (POPC) dans un flacon en verre en transférant 76 μL de solution mère de POPC à 25 mg/mL dissoute dans du chloroforme.</li>
		<li>Tout en tournant doucement le flacon en verre, soufflez un léger filet d’argon dans le flacon pour former un film de lipides séchés au fond. Ensuite, transférez le flacon en verre dans un dessiccateur avec son bouchon vissé sans serrer pour évaporer l’excès de chloroforme.</li>
		<li>Conservez le flacon en verre dans le dessiccateur pendant 1 h. Ensuite, ajoutez 0,5 mL d’eau désionisée ultra-pure pour dissoudre le film lipidique et vortex pendant environ 2 min.</li>
		<li>Mettez en place un appareil de mini-extrusion en trempant deux supports de filtre dans de l’eau désionisée et en les plaçant sur chacun des supports de membrane internes. Ensuite, trempez un filtre en polycarbonate de 100 nm et placez-le entre les deux supports de membrane internes maintenus ensemble par le boîtier extérieur de l’extrudeur et l’écrou de retenue. Placez cette configuration dans le support de l’extrudeuse.</li>
		<li>Rincez 3 fois deux seringues étanches au gaz de 1 ml avec de l’eau déminéralisée ultra-pure.</li>
		<li>Chargez l’échantillon de mélange lipide-eau dans l’une des seringues étanches au gaz de 1 ml et placez-le à une extrémité de la mini-extrudeuse à l’aide des clips du bras oscillant pour maintenir la seringue en place. Insérez la deuxième seringue dans l’autre extrémité de la mini-extrudeuse et assurez-vous qu’elle est complètement enfoncée. REMARQUE : Lorsque vous chargez la seringue avec le mélange lipide-eau, assurez-vous qu’il n’y a pas d’air dans la seringue avant de la faire passer dans la mini-extrudeuse.</li>
		<li>Passez doucement le mélange lipide-eau de la seringue d’origine à la seringue vide à travers l’appareil de mini-extrudeuse. Répétez cette étape 11 fois pour former des SUV. Transférez les VUS dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. REMARQUE : La solution SUV peut être conservée à 4 °C jusqu’à 2 semaines.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensemble de réaction CFE<ol><li>Assemblez la réaction CFE en suivant le protocole d’expression acellulaire fourni par le fabricant avec de légères modifications détaillées ci-dessous.</li>
		<li>Mélanger 10 μL de la solution 1 (contenant des acides aminés, des NTP, des ARNt et des substrats pour les enzymes, ainsi que le tampon nécessaire), 1 μL de la solution 2 (protéines dans 20 % de glycérol), 2 μL de la solution 3 (ribosome (20 μM)), une quantité appropriée d’ADN codant pour le sfGFP soluble-sfCherry(1-10)27 (ci-après dénommé sfGFP soluble), le WT-GluR0-sfGFP ou le PRSP-GluR0-sfGFP (10-60 ng/1000 paires de bases), 1 μL d’inhibiteur de l’ARNase murine, et 4 μL de solution SUV 5 mM pour les protéines membranaires ou 4 μL d’eau pour les protéines solubles.</li>
		<li>Porter le volume final de la réaction à 20 μL en ajoutant de l’eau désionisée ultra-pure. REMARQUE : Lors de l’assemblage du système CFE, tous les composants doivent être maintenus sur la glace. Tous les matériaux sont sensibles à la température et peuvent se dégrader s’ils atteignent la température ambiante.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubation et surveillance de la réaction CFE<ol><li>Transférez la solution CFE sur une plaque conique à fond en V de 96 puits. Pour éviter l’évaporation au cours de la réaction, recouvrez la plaque d’un film d’étanchéité.</li>
		<li>Incuber la plaque à 37 °C dans un lecteur de plaques pendant 4 à 5 h tout en surveillant la réaction CFE en mesurant le signal GFP avec un gain de 100 aux longueurs d’onde d’excitation/émission de 488 nm/528 nm toutes les 2 min.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Réactions CFE encapsulées dans les GUV
<ol><li>Préparation de la solution tampon extérieure GUV<ol><li>Dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL, mélanger 1,5 μL de spermidine 1 M, 37,5 μL de 100 mM d’ATP, 25 μL de 100 mM GTP, 12,5 μL de 100 mM CTP, 12,5 μL de 100 mM UTP, 25 μL de 1 M de créatine phosphate, 18 μL d’acétate de magnésium 1 M, 93,33 μL de 3 M de glutamate de potassium, 50 μL de 1 M HEPES KOH (pH 7,4), 1,15 μL d’acide folinique 332 mM, 100 μL de glucose 2 M et 50 μL de solution mère de 6 mM de mélange de chacun des 20 acides aminés (préparés en suivant le protocole décrit par Sun et al.28).</li>
		<li>Porter le volume final de la solution à 1 mL en ajoutant de l’eau déminéralisée ultra-purifiée. REMARQUE : Tous les composants doivent être conservés sur la glace. Ajouter le mélange d’acides aminés à la fin pour éviter l’épuisement des acides aminés28. La solution peut être aliquote dans des aliquotes de 330 μL et stockée à -20 °C jusqu’à son utilisation.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation du mélange lipides dans l’huile REMARQUE : cette étape doit être effectuée dans une hotte en suivant les consignes de sécurité pour travailler avec du chloroforme.<ol><li>Dans une hotte, mélanger 17,3 μL de solution mère de POPC à 25 mg/mL et 1,08 μL de copolymère de poly(butadiène)-b-poly(oxyde d’éthylène) (PEO-b-PBD) à 50 mg/mL dans un flacon en verre de 15 mL. REMARQUE : La solution finale de lipides dans l’huile contient 0,5 mM de lipides avec 95 % et 5 % de POPC et de PEO-b-PBD, respectivement. PEO-b-PBD a été utilisé pour améliorer la stabilité de la membrane pendant l’expression de la protéine, mais a été maintenu à un faible rapport molaire pour réduire la tendance du copolymère à s’agréger en micelles séparées des molécules lipidiques29,30.</li>
		<li>Soufflez doucement un léger jet d’argon dans le flacon en verre tout en tournant le flacon pour évaporer le chloroforme.</li>
		<li>Pipeter 1,2 mL d’huile minérale légère dans le flacon en verre de 15 mL contenant les lipides séchés.</li>
		<li>Mélangez les lipides et l’huile en tourbillonnant à vitesse maximale pendant 10-20 s. Le mélange lipide-copolymère dissous aura l’air trouble.</li>
		<li>Pour s’assurer que tous les agrégats lipidiques possibles dans l’huile sont complètement dissous et dispersés dans toute l’huile, placez le flacon en verre dans un four à environ 50 °C pendant 20 min avant de tourbillonner pendant 10 à 20 s supplémentaires à vitesse maximale.</li>
	</ol></li>
	<li>Assemblage et encapsulation de la réaction CFE (la figure 1 résume les étapes suivantes).<ol><li>Préparez 300 μL de la solution extérieure GUV dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL en mélangeant 270 μL de solution tampon externe CFE préparée à l’étape 2.1, 15 μL de 5 M de NaCl et 15 μL de 4,5 M KCl. REMARQUE : À cette étape, ajouter 0,45 μL de 1 M 1,4-dithiothréitol (DTT) à la solution extérieure GUV. Le but de l’ajout de NaCl et de KCl est d’ajuster l’osmolalité de la solution externe pour qu’elle corresponde à la solution CFE interne. Le volume exact de NaCl et de KCl dépend de l’ajustement souhaité de l’osmolalité. On peut ajouter soit du NaCl, soit du KCl, soit les deux pour ajuster l’osmolalité.</li>
		<li>Pipeter doucement 300 μL de mélange lipidique dans l’huile sur la solution extérieure GUV. REMARQUE : Lors de l’ajout du mélange lipide-huile, il est important que l’huile ne se mélange pas à la solution extérieure aqueuse. Après l’ajout, il doit y avoir une interface visible entre le mélange lipidique dans l’huile et la solution extérieure GUV.</li>
		<li>Incuber l’interface huile-eau à température ambiante pendant 2 h pour permettre à la monocouche lipidique de se former et de se stabiliser à l’interface.</li>
		<li>Pendant ce temps, suivez la section 1.2.1 pour assembler une réaction CFE contenant l’ADN plasmidique codant pour les variantes de protéines membranaires ou GFP soluble. Remplacez 4 μL de solution SUV 5 mM ou l’eau par 4 μL de saccharose 1 M. Cette réaction sera la solution interne GUV. REMARQUE : Un osmomètre a été utilisé pour mesurer l’osmolalité des solutions internes et externes. L’osmolalité de la solution externe a ensuite été ajustée en conséquence par l’ajout de NaCl ou d’eau. L’osmolalité de la réaction CFE est généralement d’environ 1600 mOsm/Kg. L’ajout de saccharose à la réaction augmente la densité de la solution interne, permettant ainsi aux vésicules de traverser l’interface huile-eau pendant l’étape de centrifugation. Une alternative au saccharose est la solution de gradient de densité Opti-Prep.</li>
		<li>Ajouter 600 μL de mélange lipide-huile dans le tube de microcentrifugation contenant la réaction CFE et pipeter vigoureusement de haut en bas pendant ~1 min pour émulsionner la réaction dans une solution lipidique dans l’huile et former la monocouche lipidique autour des cellules synthétiques. REMARQUE : La solution finale ne doit pas avoir de bulles et doit avoir l’air opaque.</li>
		<li>Pipetez doucement l’émulsion de solution interne sur la couche d’huile dans le tube de microcentrifugation de 1,5 mL où l’interface huile-eau a été mise en place. REMARQUE : Veillez à ne pas perturber ou déstabiliser l’interface.</li>
		<li>Centrifugeuse pendant 10 min à 2 000 x g à 4 °C. REMARQUE : La vitesse de centrifugation a été optimisée pour ce protocole. Adir et al.31 ont signalé une vitesse de centrifugation différente.</li>
		<li>Une fois la centrifugation terminée, retirez soigneusement l’excès d’huile et la solution extérieure du tube de microcentrifugation à l’aide d’une pipette. Retirer la solution extérieure jusqu’à ce que le volume restant soit d’environ 100 μL. REMARQUE : Une pastille de GUVs est généralement visible au fond du tube de la microcentrifugeuse. Cependant, l’absence d’un granulé visible ne signifie pas nécessairement qu’il n’y a pas de rendement GUV. Au lieu d’utiliser une pipette, l’excès d’huile sur le dessus de la solution externe peut être éliminé par aspiration. Il est essentiel de s’assurer que la solution lipidique dans l’huile est complètement éliminée. La contamination par l’huile dans la solution GUV peut entraîner des images de mauvaise qualité.</li>
		<li>Remettez la pastille GUV en suspension dans la solution restante de 100 μL en pipetant doucement de haut en bas. Ensuite, transférez la solution GUV sur une plaque à fond plat propre et claire à 96 puits pour l’incuber.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Incubation et imagerie de la réaction CFE encapsulée
<ol><li>Recouvrez la plaque d’un film d’étanchéité pour éviter l’évaporation. Incuber la plaque à 37 °C pendant 5-6 h. On peut utiliser un lecteur de plaques et suivre l’étape 1.3.2 pour préparer le lecteur de plaques pour l’étape d’incubation.</li>
	<li>Une fois l’incubation terminée, placez la plaque à 96 puits sur la platine d’imagerie d’un microscope inversé équipé d’une caméra EMCCD (ou d’une caméra sCMOS), d’un laser contrôlé DAQ-MX (ou d’un système de combinaison laser intégré) et d’un disque rotatif confocal CSU-X1 (ou d’un confocal à balayage laser). Concentrez-vous sur n’importe quel retour sur investissement contenant des GUV et capturez des images à une longueur d’onde d’excitation de 488 nm à l’aide d’un objectif Plan-Apochromat 60 x/1,4 NA.</li>
	<li>Enregistrez des images de GUV au format .tiff.</li>
	<li>Ouvrez les images dans un logiciel de traitement d’images (par exemple, ImageJ ou Fiji). Ouvrez le panneau de réglage Luminosité/Contraste . Ajustez la luminosité et le contraste sur les paramètres appropriés qui rendent les protéines fluorescentes visibles.</li>
	<li>Si l’objectif est de comparer l’intensité du signal de différentes protéines exprimées, empilez d’abord des images individuelles de GUV contenant différentes protéines à l’aide du panneau Images à empiler situé sous le sous-menu Image > Stacks . Ensuite, ajustez la luminosité et le contraste de toutes les images à l’aide du panneau Luminosité/Contraste .</li>
</ol>

Expression acellulaire de protéines membranaires dans des vésicules unilamellaires géantes

<ol>
	<li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+under+construction:+In+vitro+reconstitution+of+cellular+function.">Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).</li><li>Lin, A. J., Sihorwala, A. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+giant+unilamellar+vesicle+production+for+artificial+cells+-+current+challenges+and+future+directions.">Exploring giant unilamellar vesicle production for artificial cells - current challenges and future directions.</a> Small Methods. 7 (12), 2300416 (2023).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+Not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta Biomembr. 1666 (1), 105-117 (2004).</li><li>Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-free+systems+for+structural+studies+of+membrane+proteins.">Detergent-free systems for structural studies of membrane proteins.</a> Biochem Soc Trans. 49 (3), 1361-1374 (2021).</li><li>Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+encapsulation+of+reconstituted+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles.">Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> J Vis Exp. (177), e63332 (2021).</li><li>Hwang, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+vesicles+enable+mechano-responsive+hydrogel+degradation.">Hybrid vesicles enable mechano-responsive hydrogel degradation.</a> Angew Chemie Int Ed. 62 (41), e202308509 (2023).</li><li>Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+polymersomes:+a+comparative+review+towards+cell+mimicking.">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li><li>Tsumoto, K., Hayashi, Y., Tabata, J., Tomita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reverse-phase+method+revisited:+Rapid+high-yield+preparation+of+giant+unilamellar+vesicles+(GUVs)+using+emulsification+followed+by+centrifugation.">A reverse-phase method revisited: Rapid high-yield preparation of giant unilamellar vesicles (GUVs) using emulsification followed by centrifugation.</a> Colloids Surf A: Physicochem Eng Asp. 546, 74-82 (2018).</li><li>Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photostable+silicon+rhodamine+platform+for+optical+voltage+sensing.">A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing.</a> J Am Chem Soc. 137 (33), 10767-10776 (2015).</li><li>Bailoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+out-of-equilibrium+metabolism+for+synthetic+cells:+A+membrane+perspective.">Minimal out-of-equilibrium metabolism for synthetic cells: A membrane perspective.</a> ACS Synth Biol. 12 (4), 922-946 (2023).</li></ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Pratiquement tous les processus cellulaires qui dépendent du transfert de molécules ou d’informations à travers la membrane cellulaire, comme la signalisation cellulaire ou l’excitation cellulaire, nécessitent des protéines membranaires. Ainsi, la reconstitution des protéines membranaires est devenue le principal goulot d’étranglement dans la réalisation de diverses conceptions de cellules synthétiques pour différentes applications. La reconstitution traditionnelle des protéines membranaires dans les mem...

La biologie synthétique ascendante a suscité un intérêt croissant au cours de la dernière décennie en tant que domaine émergent avec de nombreuses applications potentielles en bio-ingénierie, en administration de médicaments et en médecine régénérative 1,2. Le développement des cellules synthétiques en tant que pierre angulaire de la biologie synthétique ascendante, en particulier, a attiré un large éventail de communautés scientifiques en raison des applications prometteuses des cellules synthétiques ainsi que de leurs propriétés physiques et biochimiques similaires à celles des cellules qui facilitent les études biophysiques in vitro 3,4,5,6 . Les cellules synthétiques sont souvent conçues dans des vésicules unilamellaires géantes (GUV) de la taille d’une cellule dans lesquelles différents processus biologiques sont recréés. La reconstitution du cytosquelette cellulaire 7,8, la régénération de l’énergie dépendante de la lumière9, la communication cellulaire10,11 et la biodétection12 sont des exemples d’efforts déployés pour reconstruire des comportements semblables à ceux des cellules dans les cellules synthétiques.
Alors que certains processus cellulaires reposent sur des protéines solubles, de nombreuses caractéristiques des cellules naturelles, telles que la détection et la communication, utilisent souvent des protéines membranaires, notamment des canaux ioniques, des récepteurs et des transporteurs. Un défi majeur dans le développement des cellules synthétiques est la reconstitution des protéines membranaires. Bien que les méthodes traditionnelles de reconstitution des protéines membranaires dans les bicouches lipidiques reposent sur la purification médiée par les détergents, ces méthodes sont laborieuses, inefficaces pour les protéines toxiques pour l’hôte d’expression, ou ne sont souvent pas adaptées à la reconstitution des protéines membranaires dans les GUVs13.
Les systèmes d’expression acellulaire (EFC) constituent une autre méthode d’expression des protéines. Les systèmes CFE ont été un outil puissant en biologie synthétique qui permet l’expression in vitro de diverses protéines à l’aide de lysats cellulaires ou de machines de transcription-traduction purifiées14. Les systèmes CFE peuvent également être encapsulés dans des GUV, permettant ainsi des réactions de synthèse de protéines compartimentées qui peuvent être programmées pour diverses applications, telles que la création de cellules synthétiques collectrices de lumière9 ou de biocapteurs mécanosensibles15,16. À l’instar des méthodes d’expression des protéines recombinantes, l’expression des protéines membranaires est difficile dans les systèmes CFE17. L’agrégation, le mauvais repliement et l’absence de modification post-traductionnelle dans les systèmes CFE sont des goulets d’étranglement majeurs qui entravent la synthèse réussie des protéines membranaires à l’aide des systèmes CFE. La difficulté de la reconstitution ascendante des protéines membranaires à l’aide des systèmes CFE est due en partie à l’absence d’une voie complexe de biogenèse des protéines membranaires qui repose sur des peptides de signal, des particules de reconnaissance de signaux, des translocons et des molécules chaperonneuses. Cependant, récemment, de multiples études ont suggéré que la présence de structures membraneuses telles que des microsomes ou des liposomes pendant la traduction favorise l’expression réussie des protéines membranaires 18,19,20,21. De plus, Eaglesfield et al. et Steinküher et al. ont constaté que l’inclusion de domaines hydrophobes spécifiques connus sous le nom de peptides signaux dans l’extrémité N-terminale de la protéine membranaire peut améliorer considérablement son expression22,23. Dans l’ensemble, ces études suggèrent que le défi de la reconstitution des protéines membranaires dans les cellules synthétiques peut être surmonté si la traduction des protéines se produit en présence de la membrane GUV et si le peptide signal N-terminal approprié est utilisé.
Ici, un protocole d’encapsulation de la synthèse protéique à l’aide d’éléments recombinants (PURE) pour la reconstitution des protéines membranaires dans les GUVs est présenté. Le récepteur24 du glutamate bactérien (GluR0) est sélectionné comme protéine membranaire modèle, et l’effet de son peptide signal N-terminal sur sa reconstitution membranaire est étudié. L’effet du peptide signal de la protéorhodopsine, dont Eaglesfield et al.22 ont montré qu’il améliorait l’efficacité de la reconstitution des protéines membranaires, est étudié en construisant une variante mutée de GluR0 désignée PRSP-GluR0 et en comparant son expression et sa localisation membranaire avec GluR0 de type sauvage (ci-après appelé WT-GluR0) qui héberge son peptide signal natif. Ce protocole est basé sur la méthode de l’émulsion inversée25 avec des modifications qui le rendent robuste pour l’encapsulation CFE. Dans la méthode présentée, les réactions CFE sont d’abord émulsionnées à l’aide d’une solution lipidique dans l’huile qui génère des gouttelettes de la taille d’un micron contenant le système CFE et stabilisées par la monocouche lipidique. Les gouttelettes d’émulsion sont ensuite superposées sur une interface huile-eau saturée d’une autre monocouche lipidique. Les gouttelettes d’émulsion sont ensuite forcées de se déplacer à travers l’interface huile-eau par la force centrifuge. Grâce à ce processus, les gouttelettes obtiennent une autre monocouche, générant ainsi une vésicule lipidique bicouche. Les GUVs contenant la réaction CFE sont ensuite incubés, au cours desquels la protéine membranaire est exprimée et incorporée dans la membrane GUV. Bien que ce protocole soit spécifié pour l’expression acellulaire de GluR0, il peut être utilisé pour la synthèse acellulaire d’autres protéines membranaires ou différentes applications cellulaires synthétiques telles que la reconstitution du cytosquelette ou les études de fusion membranaire26.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 nm polycarbonate filter</td>
			<td>STERLITECH</td>
			<td>1270193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Clear Bottom Plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>165305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>11-120-533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>10621714001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSU-X1 Confocal Scanner Unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CSU-X1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium (Optiprep)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optional to switch with sucrose in inner solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand microtubes (1.5 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid calcium salt hydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>158968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon X3 camera&#160;</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897E-CS0&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light mineral oil</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate tetrahydrate&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX81 Inverted Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B933&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEO-b-PBD</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P41745-BdEO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA</td>
			<td>Homemade</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA</td>
			<td>Homemade</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA</td>
			<td>Homemade</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC lipid in chloroform&#160;</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850457C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PUREfrex 2.0</td>
			<td>Cosmo Bio USA</td>
			<td>GFK-PF201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Set</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor, Murine</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>Biotechrabbit</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600</td>
			<td>ELITechGroup</td>
			<td>VAPRO 5600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of the bacterial glutamate receptor channel by encapsulation of a cell-free expression system

Les systèmes d’expression acellulaire (CFE) sont des outils puissants en biologie synthétique qui permettent le biomimétisme des fonctions cellulaires telles que la biodétection et la régénération d’énergie dans les cellules synthétiques. La reconstruction d’un large éventail de processus cellulaires nécessite toutefois une reconstitution réussie des protéines membranaires dans la membrane des cellules synthétiques. Alors que l’expression des protéines solubles est généralement réussie dans les systèmes CFE courants, la reconstitution des protéines membranaires dans les bicouches lipidiques des cellules synthétiques s’est avérée être un défi. Ici, une méthode de reconstitution d’une protéine membranaire modèle, le récepteur du glutamate bactérien (GluR0), dans des vésicules unilamellaires géantes (GUVs) en tant que cellules synthétiques modèles, basée sur l’encapsulation et l’incubation de la réaction CFE à l’intérieur de cellules synthétiques, est démontrée. En utilisant cette plateforme, l’effet de la substitution du peptide signal N-terminal de GluR0 par le peptide signal de la protéorhodopsine sur la translocation cotraductionnelle réussie de GluR0 dans les membranes de GUVs hybrides est démontré. Cette méthode fournit une procédure robuste qui permettra la reconstitution acellulaire de diverses protéines membranaires dans des cellules synthétiques.

Bottom-up synthetic biology has gained increasing interest over the past decade as an emerging field with numerous potential applications in bioengineering, drug delivery, and regenerative medicine1,2. The development of synthetic cells as a cornerstone of bottom-up synthetic biology, in particular, has attracted a wide range of scientific communities due to the promising applications of synthetic cells as well as their cell-like physical and biochemical properties that facilitate in vitro biophysical studies3,4,5,6. Synthetic cells are often engineered in cell-sized giant unilamellar vesicles (GUVs) in which different biological processes are recreated. Reconstitution of cell cytoskeleton7,8, light-dependent energy regeneration9, cellular communication10,11, and biosensing12 are examples of efforts made to reconstruct cell-like behaviors in synthetic cells.
While some cellular processes rely on soluble proteins, many characteristics of natural cells, such as sensing and communication, often utilize membrane proteins, including ion channels, receptors, and transporters. A major challenge in synthetic cell development is the reconstitution of membrane proteins. Although traditional methods of membrane protein reconstitution in lipid bilayers rely on detergent-mediated purification, such methods are laborious, ineffective for proteins that are toxic to the expression host, or are often not suited for membrane protein reconstitution in GUVs13.
An alternative method for protein expression is cell-free expression (CFE) systems. CFE systems have been a powerful tool in synthetic biology that allows in vitro expression of various proteins using either cell lysate or purified transcription-translation machinery14. CFE systems can also be encapsulated in GUVs, thus allowing compartmentalized protein synthesis reactions that can be programmed for various applications, such as the creation of light-harvesting synthetic cells9 or mechanosensitive biosensors15,16. Analogous to recombinant protein expression methods, membrane protein expression is challenging in CFE systems17. Aggregation, misfolding, and lack of post-translational modification in CFE systems are major bottlenecks that hinder successful membrane protein synthesis using CFE systems. The difficulty of bottom-up membrane protein reconstitution using CFE systems is due in part to the absence of a complex membrane protein biogenesis pathway that relies on signal peptides, signal recognition particles, translocons, and chaperoning molecules. However, recently, multiple studies have suggested that the presence of membranous structures such as microsomes or liposomes during translation promotes successful membrane protein expression18,19,20,21. Additionally, Eaglesfield et al. and Steink&#252;her et al. have found that the inclusion of specific hydrophobic domains known as signal peptides in the N-terminus of the membrane protein can significantly improve its expression22,23. Altogether, these studies suggest that the challenge of membrane protein reconstitution in synthetic cells can be overcome if the protein translation occurs in the presence of the GUV membrane and if proper N-terminal signal peptide is utilized.
Here, a protocol for encapsulation of the protein synthesis using recombinant elements (PURE) CFE reactions for membrane protein reconstitution in GUVs is presented. Bacterial glutamate receptor24 (GluR0) is selected as the model membrane protein, and the effect of its N-terminal signal peptide on its membrane reconstitution is studied. The effect of proteorhodopsin signal peptide, which was shown to improve membrane protein reconstitution efficiency by Eaglesfield et al.22, is investigated by constructing a mutated variant of GluR0 denoted as PRSP-GluR0 and its expression and membrane localization with wild-type GluR0 (referred to as WT-GluR0 hereafter) that harbors its native signal peptide is compared. This protocol is based on the inverted emulsion method25 with modifications that make it robust for CFE encapsulation. In the presented method, the CFE reactions are first emulsified using a lipid-in-oil solution that generates micron-sized droplets that contain the CFE system and are stabilized by the lipid monolayer. The emulsion droplets are then layered on top of an oil-water interface that is saturated with another lipid monolayer. The emulsion droplets are then forced to travel across the oil-water interface via centrifugal force. Through this process, the droplets obtain another monolayer, thus generating a bilayer lipid vesicle. The GUVs containing the CFE reaction are then incubated, during which the membrane protein is expressed and incorporated into the GUV membrane. Although this protocol is specified for cell-free expression of GluR0, it can be used for cell-free synthesis of other membrane proteins or different synthetic cell applications such as cytoskeleton reconstitution or membrane fusion studies26.

Pleins feux sur l’auteur : Reconstitution des protéines membranaires dans les cellules synthétiques

Reconstitution du canal récepteur du glutamate bactérien par encapsulation d’un système d’expression acellulaire

Our protocol addresses the reconstitution of a membrane protein within the lipid bilayer of a synthetic cell made using the inverted droplet emulsion method. The advantage of using the inverted droplet emulsion method is its ability to generate synthetic cells that provide a stable environment for the cell-free expression of membrane proteins. Our protocol offers a robust method for researchers in the field to synthesize membrane proteins inside synthetic cells using cell-free expression system.My lab is working on reconstituting various ion channels in synthetic cells through the reconstitution of the action potential by a well-defined set of ion channels.

Avant l’encapsulation des réactions CFE, deux variantes de GluR0-sfGFP hébergeant des peptides signaux natifs et protéorhodopsines (les séquences de peptides signaux sont présentées dans le tableau supplémentaire 1), et la sfGFP soluble ont été exprimées individuellement dans des réactions globales, et leur expression a été surveillée en détectant le signal sfGFP à l’aide d’un lecteur de plaques (Figure 2A). Les protéines membranaires ...

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Ce protocole décrit la méthode d’émulsion inversée utilisée pour encapsuler un système d’expression acellulaire (CFE) dans une vésicule unilamellaire géante (GUV) pour l’étude de la synthèse et de l’incorporation d’une protéine membranaire modèle dans la bicouche lipidique.

Cell-free expression (CFE) systems are powerful tools in synthetic biology that allow biomimicry of cellular functions like biosensing and energy ...

Notre protocole porte sur la reconstitution d’une protéine membranaire au sein de la bicouche lipidique d’une cellule synthétique réalisée par la méthode de l’émulsion de gouttelettes inversées. L’avantage d’utiliser la méthode d’émulsion de gouttelettes inversées est sa capacité à générer des cellules synthétiques qui fournissent un environnement stable pour l’expression acellulaire des protéines membranaires. Notre protocole offre aux chercheurs sur le terrain une méthode robuste pour synthétiser des protéines membranaires à l’intérieur de cellules synthétiques à l’aide d’un système d’expression acellulaire.Mon laboratoire travaille sur la reconstitution de divers canaux ioniques dans des cellules synthétiques par la reconstitution du potentiel d’action par un ensemble bien défini de canaux ioniques.

reconstitution-bacterial-glutamate-receptor-channel-encapsulation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Reconstitution of the Bacterial Glutamate Receptor Channel by Encapsulation of a Cell-Free Expression System

787 vues.  University of Michigan, Ann Arbor. Notre protocole porte sur la reconstitution d’une protéine membranaire au sein de la bicouche lipidique d’une cellule synthétique réalisée par la méthode de l’émulsion de gouttelettes inversées. L’avantage d’utiliser la méthode d’émulsion de gouttelettes inversées est sa capacité à générer des cellules synthétiques qui fournissent un environnement stable pour l’expression acellulaire des protéines membranaires. Notre protocole offre aux chercheurs sur le terrain ...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Reconstitution des protéines membranaires dans les cellules synthétiques

Cell-free expression (CFE) systems are powerful tools in synthetic biology that allow biomimicry of cellular functions like biosensing and energy regeneration in synthetic cells. Reconstruction of a wide range of cellular processes, however, requires successful reconstitution of membrane proteins into the membrane of synthetic cells. While the expression of soluble proteins is usually successful in common CFE systems, the reconstitution of membrane proteins in lipid bilayers of synthetic cells has proven to be challenging. Here, a method for reconstitution of a model membrane protein, bacterial glutamate receptor (GluR0), in giant unilamellar vesicles (GUVs) as model synthetic cells based on encapsulation and incubation of the CFE reaction inside synthetic cells is demonstrated. Utilizing this platform, the effect of substituting the N-terminal signal peptide of GluR0 with proteorhodopsin signal peptide on successful cotranslational translocation of GluR0 into membranes of hybrid GUVs is demonstrated. This method provides a robust procedure that will allow cell-free reconstitution of various membrane proteins in synthetic cells.

This protocol describes the inverted emulsion method used to encapsulate a cell-free expression (CFE) system within a giant unilamellar vesicle (GUV) for the investigation of the synthesis and incorporation of a model membrane protein into the lipid bilayer.

Recherche

Bio-ingénierie

Bulk Cell-Free Expression Reactions with Small Unilamellar Vesicles (SUVs) for Synthetic Cell Applications

To begin, blow a gentle stream of Argonne into a glass vial containing POPC lipids while gently rotating the vial. When the lipids have dried as a film at the bottom of the vial, loosely cap it, then transfer it to a desiccater. After one hour add 0.5 milliliters of ultrapure deionized water to dissolve the lipid film.Vortex the solution for two minutes. Next, soak two filter supports and deionized water. Place them on each of the internal membrane supports.Then place a 100 nanometer polycarbonate filter between the two internal membrane supports, held together by the extruder outer casing and retainer nut. Place the setup in the extruder stand to finish setting up the mini extrusion apparatus. Next, load the lipid water mix into a one milliliter gast tight syringe.Use swing arm clips to secure the syringe into one end of the mini extruder. Insert the second syringe into the other end of the mini extruder, making sure that it is fully depressed. Now pass the lipid water mix from the original syringe into the empty one through the apparatus.After repeating the extrusion 11 times, transfer the SUVs to a 1.5 milliliter micro centrifuge tube. To assemble the cell-free expression protocol, pipette solutions one to 3 DNA plasmid encoding for soluble SFGFP or variants of glutamate receptor SFGFP, murine RNAse, and SUV solution into a vial. Add ultrapure deionized water to bring the reaction volume to 20 microliters.Transfer the cell-free expression solution to a 96 well conical V bottom plate. Incubate the plate in a plate reader at 37 degrees Celsius for four to five hours. Set up the plate reader with a gain of 100, excitation of 485 nanometers, emission of 528 nanometers, a runtime of five hours, and an interval measurement of one read for every two minutes.Measure the GFP signal every two minutes to monitor the cell-free reaction in real time. Soluble SFGFP had the highest expression among all three proteins.

Réactions d’expression acellulaire en vrac avec de petites vésicules unilamellaires (SUV) pour des applications de cellules synthétiques

Cell-Free Reactions in Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) for Synthetic Cell Applications

To begin, prepare the GUV outer buffer solution in a 1.5-milliliter microcentrifuge tube. Mixed together spermidine, ATP, GTP, CTP, UTP, creatine phosphate, magnesium acetate, potassium glutamate, HEPES, potassium hydroxide, folinic acid. glucose, and amino acid stock.Add ultra purified deionized water to bring the final volume of the solution to one milliliter. Next, in a fume hood, add 17.3 microliters of POPC stock solution to a 15-milliliter glass vial. To this, pipette 1.08 microliters of PEO-b-PBD copolymer.Carefully blow a gentle stream of argon gas into the glass vial while rotating the vial to evaporate the chloroform. Then pipette 1.2 milliliters of light mineral oil into the glass vial. Vortex the lipid and oil at maximum speed for 10 to 20 seconds.Place the glass vial in an oven at around 50 degrees Celsius for 20 minutes before vortexing for an additional 10 to 20 seconds at maximum speed. Next, pipette 270 microliters of the GUV outer solution into a 1.5-milliliter microcentrifuge tube. To this, pipette 15 microliters each of five molar sodium chloride and 4.5 molar potassium chloride.Gently pipette 300 microliters of lipid and oil mixture on top of the GUV outer solution. After incubation, assemble a CFE reaction by pipetting Solutions 1 to 3, DNA plasmid encoding for soluble sfGFP or variants of glutamate receptor sfGFP, murine RNAse, and one molar sucrose into a vial. Add ultrapure deionized water to bring the reaction volume to 20 microliters.Add 600 microliters of the lipid-oil mixture to the microcentrifuge tube containing the 20-microliter reaction mixture. Pipette up and down vigorously for one minute to emulsify the reaction. Gently layer the inner emulsion on top of the oil layer in the tube.Centrifuge for 10 minutes at 2000 g at four degrees Celsius. Next, carefully pipette out the excess oil and outer solution from the microcentrifuge tube. Gently mix the GUV pellet in the remaining solution to resuspend it.Transfer the GUV solution to a clean 96-well clear flat bottom plate for incubation. Transfer the sealed plate into a plate reader to incubate at 37 degrees Celsius for five to six hours. After incubation, place the plate on an inverted confocal microscope.Focus on a region of interest containing the GUVs, then capture the images at an excitation wavelength of 488 nanometers. Save the images in the TIFF format. Open the images in an image processing software.Click on the Brightness/Contrast setting panel to open it. Then adjust the brightness and contrast to make the fluorescent proteins visible. The wild-type glutamate receptor cell-free expression reactions encapsulated in GUV demonstrated excellent expression and membrane localization.PRSP-glutamate receptor was prone to aggregation and punctate formation. The soluble sfGFP was expressed in GUVS and stayed in the GUV lumen.