Pour commencer, préparez les supports de pinces et les pinces métalliques. Placez les supports de pince assortis avec une pince métallique chacun dans la station de montage. Placez des morceaux de papier autoclavés humides sur les pinces métalliques.
Coupez le papier le long des bords intérieurs des pinces avec le scalpel. Coupez deux autres petits morceaux de papier et gardez-les humides. À l’aide d’une pince à épiler pointue, placez huit explants de carottes sur le papier entre les pinces métalliques avec leurs extrémités sur les pinces.
Couvrez les extrémités des explants de carottes avec des morceaux de papier plus petits et placez des pinces métalliques sur le dessus. Utilisez un tournevis et de petites vis pour fixer les explants du noyau entre les pinces métalliques et le support de pince. Transférez soigneusement les explants à noyau clampé dans des chambres de culture en silicone et remplissez ces chambres avec deux millilitres de milieu de culture cellulaire standard.
Fixez ensuite l’assemblage avec des vis supplémentaires. Pour préparer l’hydrogel de collagène, retirez d’abord les cellules cibles des boîtes de culture tissulaire à l’aide d’une solution de détachement cellulaire. Puis centrifuger à 400G pendant cinq minutes à température ambiante puis remettre en suspension dans un millilitre de milieu de culture standard.
Ensuite, préparez une solution de réticulation en mélangeant 10 microlitres de PBS, 1,28 microlitre d’une molaire de NaOH et 8,72 microlitres d’eau double distillée par assembloïde. Ajoutez la suspension cellulaire de 12 assembloïdes maximum et placez le tube sur de la glace. Ajuster la suspension cellulaire de manière à atteindre les concentrations finales suivantes.
Préparez séparément une solution de collagène en ajoutant 80 microlitres de collagène un par assembloïde et placez le tube sur de la glace. Une fois les solutions prêtes sur glace, aspirer le milieu de culture cellulaire des chambres contenant les explants du noyau serré. Ajouter une solution de collagène à la solution de réticulation et mélanger en pipetant rapidement sans créer de bulles.
Ajoutez 200 microlitres de solution mélangée dans les rainures des chambres en silicone pour couvrir les explants de noyau de tendon individuels. Laissez les hydrogels polymériser pendant 50 minutes à 37 degrés Celsius. Remplissez ensuite soigneusement les chambres de culture en silicone avec 1,5 millilitre du milieu de co-culture respectif en le pipetant dans les coins des chambres.
Placez les chambres dans une grande boîte de Pétri ou une boîte stérile avant de les mettre dans un incubateur. Cultivez les assembloïdes dans des conditions appropriées, en changeant de milieu de culture deux fois par semaine. Retirez les assemblages des pinces avec des ciseaux.
Si nécessaire, utilisez une pince à épiler pour séparer les explants du noyau du compartiment externe de l’hydrogel. Après avoir cultivé l’assembloïde dans des conditions de culture semblables à des lésions pendant plus de 21 jours, il a été observé que l’explant du noyau restait mécaniquement extensible, inchangé en apparence, visuellement distinguable et physiquement séparable de l’hydrogel environnant. De plus, l’hydrogel environnant s’est compacté avec le temps, en fonction de la population de cellules ensemencées, les fibroblastes dérivés du tendon d’Achille contractant leur hydrogel environnant le plus rapidement.
L’évaluation de la viabilité, de la morphologie et de la propagation cellulaire en microscopie confocale dans l’hydrogel de collagène 3D a révélé que la viabilité était conservée pendant la culture assembloïde jusqu’au septième jour au moins. De plus, l’expression génique de Vegfa et de Mmps a fortement augmenté dans les explants de carottes, comme le montre l’analyse transcriptomique. De même, l’analyse du sécrétome a détecté la présence de cytokines telles que le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire dans les explants du noyau.
