Pour commencer, décongelez le réactif de digestion cellulaire enzymatique à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Sous un microscope à fond clair à un grossissement de 10x, observez les organoïdes intestinaux humains tridimensionnels différenciés pour assurer la santé des cellules. Remplacez le milieu des puits d’une plaque de 24 puits contenant des organoïdes différenciés par 500 microlitres de solution de récupération de cellules froides.
Pipette de haut en bas pour libérer les cellules de la membrane basale. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Incuber le tube sur de la glace pendant 10 minutes, en pipetant de haut en bas toutes les cinq minutes.
Centrifugez la suspension cellulaire à 400 g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant du tube sans déranger la pastille. Remettez la pastille en suspension dans 500 microlitres de réactif de digestion cellulaire enzymatique préchauffé, en pipetant 10 fois de haut en bas.
Placez les organoïdes pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone. Toutes les 10 minutes, pipetez 10 fois l’ensemble du volume à l’aide d’une pipette P1000 pour aider à dissocier les cellules. Centrifugez la suspension cellulaire à 400 g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de milieu de différenciation.
Pipetez rapidement les cellules de haut en bas 50 fois sur de la glace pour dissocier les organoïdes en cellules uniques. Filtrez tout le volume à travers une passoire à pointe de 70 microns et recueillez l’éluat dans un tube frais de 1,5 millilitre. Filtrez ensuite l’éluat obtenu à travers une passoire de 70 microns sur une passoire à pointe de 40 microns.
Ajoutez cinq microlitres de Trypan Blue à 0,4 % à cinq microlitres de suspension cellulaire et comptez les cellules uniques viables à l’aide de Trypan Blue Exclusion. Diluer l’échantillon avec un milieu de culture cellulaire pour obtenir 1000 cellules par microlitre. Au total, 4 402 cellules uniques ont été isolées à partir d’organoïdes intestinaux humains tridimensionnels iléaux différenciés, représentant les types de cellules attendus, y compris les entérocytes absorbants et les cellules sécrétoires.
