Préparation de suspensions unicellulaires à partir d’organoïdes intestinaux humains différenciés en monocouches à 96 puits

Pour commencer, préparez le réactif de digestion cellulaire enzymatique et le PBS/EDTA pour la digestion des organoïdes intestinaux humains. Au microscope à fond clair, confirmez la croissance d’organoïdes intestinaux humains tridimensionnels différenciés sous forme de monocouches. Jetez le milieu de culture cellulaire de la culture monocouche et remplacez-le par 100 microlitres de PBS/EDTA.

Après avoir éliminé le PBS/EDTA, ajoutez 100 microlitres de réactif de digestion cellulaire enzymatique chaud dans chaque puits. Placez la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone et pipetez tout le volume cinq fois toutes les 10 minutes pendant 20 à 30 minutes. Transférez un à deux microlitres de suspension cellulaire sur une lame de verre toutes les 10 minutes pour évaluer la dissociation en observant le pourcentage de cellules uniques.

Après dissociation, combinez trois puits répliqués par condition dans un seul tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Ajouter 700 microlitres de milieu de différenciation de culture cellulaire contenant 10 inhibiteurs micromolaires de ROCK, et mélanger doucement par pipetage. Filtrez tout le volume à travers une passoire à pointe de 70 microns, en recueillant le flux dans un tube frais de 1,5 millilitre.

Filtrer le flux obtenu à travers une passoire de 70 microns sur une crépine à pointe de 40 microns. Ajoutez cinq microlitres de bleu trypan à 0,4 % à cinq microlitres de suspension cellulaire et comptez les cellules uniques viables. Diluer l’échantillon avec un milieu de culture cellulaire contenant un inhibiteur de ROCK pour obtenir 1 000 cellules par microlitre.

Au total, 9 952 cellules uniques ont été isolées à partir d’organoïdes intestinaux humains différenciés cultivés dans des plaques de 96 puits.