Pour commencer, mettez en plaque HEK293T cellules en ajoutant 22 millilitres de milieu de culture supplémenté dans 10 boîtes de culture traitées de 15 centimètres de diamètre. Incuber les plaques pendant 24 heures pour atteindre 70 à 80% de confluence. Pour la transfection cellulaire, préparez un mélange en combinant les réactifs dans un tube de microcentrifugation et mélangez par tapotement.
Ajouter le mélange de transfection à 4,56 millilitres de DMEM non supplémenté dans un tube à centrifuger de 50 millilitres et mélanger en tapotant . Ensuite, ajoutez 1,37 millilitre de solution stérile de polyéthylèneimine goutte à goutte. Mélanger en tapotant et incuber à température ambiante pendant 10 minutes pour former des complexes d’ADN polyéthylèneimine.
Ajoutez ce mélange dans 231 millilitres de DMEM supplémenté préchauffé. Remplacez le milieu de culture dans chaque boîte de culture par 22 millilitres de ce mélange de transfection et incubez les cellules pendant 48 heures. Si le PITR code un rapporteur fluorescent, observez les cellules transfectées au microscope à fluorescence.
Ensuite, récupérez le milieu de chaque plat. Centrifugez à 800G pendant 10 minutes et retirez le surnageant. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de PBS préchauffé dans la plaque et utilisez un grattoir à cellules pour retirer les cellules.
Collectez la suspension cellulaire dans les tubes de centrifugation contenant la pastille de cellule. Assurez-vous que toutes les cellules sont prélevées en lavant cinq plats à la fois avec 10 millilitres de PBS. Centrifugez à nouveau pour granuler les cellules.
Pour l’extraction rAAV, décongelez les granules de cellules transfectées et mettez-les en suspension dans 100 millilitres de tampon stérile et de pipette pour assurer une suspension homogène. Ensuite, ajoutez 12,5 millilitres d’une solution stérile de désoxycholate de sodium à 10 % fraîchement préparée pour induire la lyse cellulaire et mélangez par pipetage. Ajouter 27 microlitres de nucléase de benzonase et bien mélanger jusqu’à ce que le mélange ne soit plus visqueux.
Incuber à 37 degrés Celsius, en tourbillonnant toutes les 10 minutes, pendant une heure. Centrifugeuse à 3 000 G pendant 60 minutes à 25 degrés Celsius. Filtrez le surnageant à l’aide d’un filtre à seringue en PVDF de 0,45 micron dans un nouveau récipient stérile.
