Pour commencer, préparez le système FPLC pour la purification. Rincez abondamment le chemin d’écoulement du liquide avec de l’eau ultrapure stérile en utilisant des instructions manuelles ou une méthode personnalisée. Connectez une colonne d’héparine pré-emballée d’un millilitre.
Réglez l’alarme de pression. Et laver avec cinq volumes de colonne d’eau ultrapure à un débit d’un millilitre par minute. Ensuite, changez les solutions pour les pompes du système afin de préparer l’application de l’échantillon.
Lavez la pompe du système B avec le tampon B et remplissez le reste du chemin d’écoulement du liquide avec le tampon A.Insérez le tube d’échantillonnage de la pompe d’échantillonnage dans la préparation virale. Vous pouvez également utiliser une super boucle pour l’échantillon. Insérez le tube de sortie dans un nouveau récipient.
Lors de la première réalisation de la purification, définissez une méthode personnalisée pour la purification automatique. Après avoir activé les paramètres généraux de purification, la méthode amorcera le chemin d’écoulement de l’entrée de l’échantillon S1 à la vanne d’injection avec la solution de l’échantillon. Ensuite, équilibrez la colonne avec un total de cinq volumes de colonne en utilisant 12,5 % de tampon B à raison d’un millilitre par minute.
Appliquez l’échantillon sur la colonne à raison de 0,5 millilitre par minute et collectez le débit à l’aide de l’orifice de sortie. Lavez la colonne avec 20 volumes de colonne de tampon A à raison d’un millilitre par minute. Ensuite, éluez l’échantillon à un millilitre par minute avec ce schéma.
Sélectionnez cette option pour collecter l’échantillon élué en fractions d’un millilitre à l’aide d’un collecteur de fractions. Rééquilibrez ensuite la colonne à raison d’un millilitre par minute avec 12,5 % de tampon B pour cinq volumes de colonne. Ouvrez la méthode créée et attendez l’étape d’élution.
Collectez les fractions à l’aide d’un collecteur de fractions. De plus, prélevez une aliquote de l’écoulement et stockez les fractions à moins 20 degrés Celsius. Évaluez le chromatogramme enregistré automatiquement de toutes les étapes de purification.
Y compris le profil d’élution. Une fois l’opération terminée, remplacez les entrées des solutions tampons par de l’eau ultrapure et lavez la colonne à raison d’un millilitre par minute pour cinq volumes de colonne. En restaurant la colonne, passez de l’eau ultra-pure à l’éthanol à 20 % et lavez la colonne sur cinq volumes de colonne.
Pour concentrer les rAAV, chargez les fractions FPLC souhaitées dans une unité de filtration centrifuge de 15 millilitres avec une coupure de poids moléculaire de 100 kilodaltons. Centrifuger à 2 000 G pendant deux minutes à température ambiante pour atteindre un volume concentré d’environ 500 microlitres. Poursuivez l’échange de tampon en ajoutant un millilitre de PBS stérile dans l’unité de filtration centrifuge.
Lavez le filtre par pipetage. Et centrifuger à des intervalles d’une minute jusqu’à atteindre un volume de 500 microlitres. Concentrez davantage les rAAV en transférant cet échantillon de 500 microlitres dans une unité de filtration centrifuge de 0,5 millilitre avec une coupure de 100 kilodaltons.
Et la centrifugation à 6 000 G pendant une minute d’intervalle jusqu’à ce que le volume soit inférieur à 100 microlitres. Récupérez le rAAV concentré en inversant le dispositif de filtration dans un nouveau micro-tube de centrifugation et en centrifugeant pour transférer les rAAV dans le tube. Aliquotez les rAAV dans des microtubes de centrifugation à faible rétention et stockez-les à moins 80 degrés Celsius.
La pureté des préparations de rAAV a été analysée à l’aide de la page SDS, révélant des bandes de protéines de capside distinctes. La visualisation des particules virales par TEM a montré des particules vides avec un centre dense en électrons et des particules pleines. L’évaluation des propriétés d’impuretés physiques des rAAV à l’aide de la plateforme d’étourdissement a révélé des particules de capside intactes d’environ 30 nanomètres, un titre global de capside, des protéines libres et agrégées et de l’ADN monocaténaire.
Les tests d’infectiosité dans les cellules neuro 2a ont montré des niveaux d’infectivité élevés. Cultures neuronales primaires infectées par les préparations virales mises en évidence. propriétés préservées du transfert de gènes.
La transduction in vivo du cervelet de souris avec des vecteurs rAAV a entraîné une expression prolongée de la GFP. Indication de l’expression réussie du transgène dans le cerveau des mammifères.
