Pour commencer, pipetez un à deux millilitres de solution de rinçage anti-adhérence dans un tube conique de 15 millilitres. Faites tourner le tube pour enrober sa surface. Ensuite, pipetez cinq millilitres de solution DPBS dans le tube après avoir retiré la solution anti-adhérence.
Boucher les tubes revêtus jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Pipetez n’importe quel milieu dans une plaque contenant les dômes organoïdes intestinaux humains. À l’aide d’une pipette d’un millilitre, ajoutez un millilitre de milieu DMEM/F-12 froid directement dans le dôme pour le détacher de la plaque.
Pipetez un autre millilitre du milieu pour récolter les organoïdes restants. Transférez la suspension dans les tubes coniques revêtus de 15 millilitres. Pipetez la suspension de haut en bas pour désintégrer les organoïdes jusqu’à ce qu’une suspension de fragments uniforme avec la taille d’organoïde souhaitée soit créée.
Ensuite, pipetez une aliquote de la suspension pour le comptage. Placez le reste de la suspension sur de la glace. Dessinez une grille XY au fond de chaque puits d’une plaque à fond plat de 96 puits.
Pipette 50 microlitres de DPBS dans les puits. Transférez cinq microlitres d’aliquote dans chaque puits. Comptez manuellement le nombre total d’organoïdes de 50 à 200 micromètres de diamètre.
Utilisez ensuite l’équation donnée pour calculer le volume de la suspension organoïde. Après avoir compté les organoïdes, retirez le surnageant et la couche trouble du tube contenant la suspension en touffes restante. Ensuite, pipetez deux millilitres de DMEM/F-12 froid directement sur la pastille.
Centrifuger la suspension à 200 G pendant cinq minutes à température ambiante. Pour un système d’origine animale, ajoutez 40 microlitres de froid une pastille organoïde matricielle d’origine animale. Pipetez les organoïdes de haut en bas pour les répartir dans la matrice.
Transférez doucement le mélange d’organoïdes matriciels au centre d’une plaque de culture tissulaire stérile et préchauffée à 24 puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour assurer la gélification du dôme. Ensuite, pipetez 0,5 millilitre de milieu de croissance organoïde intestinal chaud sur les côtés du puits sans perturber le dôme avant l’incubation.
Pour le système organoïde sans xénoïde matricielle, ajoutez 50 microlitres de milieu de croissance organoïde 3X à la pastille sphéroïde. Ensuite, pipetez 100 microlitres de la matrice sélectionnée, quatre organoïdes sans xéno, dans la suspension. Ajoutez 40 microlitres du mélange d’organoïdes d’hydrogel au centre d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits.
Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après l’incubation, pipetez 0,5 millilitre de milieu de croissance organoïde le long des côtés du puits. Ensuite, incubez à nouveau la plaque à 37 degrés Celsius sous une supplémentation en dioxyde de carbone de 5 % et une humidité de 95 %.
