Pour commencer, préparez 30 microlitres de tampon de coloration à des concentrations de travail 2x pour les contrôles monocolores et FMO. Transférez le tampon de coloration de contrôle monocolore et FMO dans les puits d’une plaque à 96 puits. Remplissez le volume avec 20 microlitres de tampon FACS.
Pour colorer l’échantillon, préparez 0,5 millilitre de tampon de coloration 2x FACS dans des tubes à centrifuger de 1,5 millilitre. Pipette de 10 microlitres de la suspension cellulaire vers des puits de contrôle monocolore et FMO. Ensuite, ajoutez 2 tampons de coloration FACS au reste de la suspension cellulaire et incuber.
Ensuite, ajoutez 100 microlitres de tampon FACS dans les puits et deux millilitres de tampon dans les tubes d’échantillon. Centrifuger à 500G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Aspirez le surnageant, puis remettez en suspension la pastille cellulaire dans le tampon de viabilité.
Ajoutez 300 microlitres de milieu de prolifération dans des tubes à centrifuger de 1,5 millilitre. Ceux-ci serviront de tubes de collecte pour le tri des cellules. Après avoir trié les cellules à l’aide de FACS, centrifugez les cellules collectées à 800G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.
À l’aide d’une pipette P1000, retirez délicatement le surnageant sans déranger la pastille. Remettre la pastille en suspension dans un milieu de prolifération jusqu’à une densité finale de 100 cellules par microlitre. Ensemencez la suspension cellulaire dans les puits d’une plaque de culture tissulaire de 48 puits.
Enfin, transférez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius sous supplémentation en gaz jusqu’à ce que les cellules soient confluentes. Des cellules confluentes avec une morphologie typique de fibroblastes ont été obtenues dans les cinq jours suivant la culture.
