Pour commencer, préparez la mémoire tampon maître. Filtrez-le à l’aide d’un filtre à pores de 0,22 micromètre et stockez le tampon à 4 degrés Celsius. Ensuite, préparez 75 millilitres de tampon d’extraction en complétant le tampon principal avec trois comprimés inhibiteurs de protéase sans EDTA, 2 millimolaires d’ATP et 0,1 millimolaire de DTT.
Ajoutez ensuite 75 millilitres de tampon d’extraction à la pastille de cellules bactériennes congelée exprimant la myosine VIIA, et laissez la pastille dans le tampon d’extraction sur de la glace jusqu’à ce qu’elle décongèle. Après cela, utilisez une pipette sérologique pour briser la pastille afin d’accélérer le processus de décongélation. Maintenant, sonisez la suspension sur la glace pendant 10 minutes à 50% d’amplitude à l’aide d’une pointe d’un demi-pouce avec 5 secondes de marche et 5 secondes de désactivation.
Centrifuger le lysat total à 33, 746 G pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius. Pendant la centrifugation, laver 3 millilitres de la suspension à 50% de résine affinitaire anti-FLAG avec 40 millilitres de PBS pour préparer 1,5 millilitres de résine FLAG. Ensuite, centrifugez la résine à 800 G pendant 2 minutes à 4 degrés Celsius.
Retirez délicatement le PBS sans déranger la résine. Ajoutez ensuite le surnageant de la centrifugation du lysat à la résine lavée et incubez avec une rotation continue à 4 degrés Celsius pendant 1 heure. Granulez la résine par centrifugation à 800 G pendant 2 minutes à 4 degrés Celsius.
Et retirez le surnageant sans perturber la résine. Ensuite, mettez la résine en suspension dans 40 millilitres de tampon maître et centrifugez à 800 G pendant 2 minutes à 4 degrés Celsius. Retirez délicatement le surnageant sans déranger la résine.
Transférez maintenant la résine lavée dans deux colonnes d’essorage en polypropylène. Lavez chaque colonne une fois avec 2 millilitres de tampon principal. Ensuite, centrifugez la colonne à 1 400 G pendant 2 minutes à 4 degrés Celsius pour retirer la mémoire tampon maîtresse.
Pour préparer un tampon d’élution, ajoutez 100 microgrammes par millilitre de peptide FLAG dans le tampon maître. Ajoutez 300 microlitres de tampon d’élution à la résine tassée dans chaque colonne. Mélangez doucement par pipetage pour vous assurer que la résine est complètement hydratée par le tampon d’élution.
Centrifugez ensuite les colonnes à 1 400 G pendant 2 minutes à 4 degrés Celsius. Transférez le flux dans un micro-tube de centrifugation propre et conservez-le sur de la glace. Maintenant, effectuez SDS-PAGE avec les fractions d’élution pour déterminer leurs concentrations relatives.
Pendant que le gel coule, préparez un tampon de dialyse avec la composition donnée. Combinez ensuite les fractions les plus concentrées. Transférez l’échantillon dans une cassette de dialyse de coupure de 10 000 poids moléculaire et dialysez pendant la nuit à 4 degrés Celsius.
Le lendemain, déchargez soigneusement l’échantillon de la cassette de dialyse. Aliquote 15 microlitres par tube PCR et déposez les tubes dans un récipient d’azote liquide pour la congélation instantanée. Le complexe VIIA de la myosine VIIA purifiée a été confirmé par SDS-PAGE, montrant une bande au-dessus du marqueur Dalton de 200 kilos, correspondant à la chaîne lourde de la myosine VIIA, et trois bandes distinctes entre les marqueurs Dalton de 22 et 14 kilos représentant la calmoduline RLC et la protéine 4 de type calmoduline.
