Pour commencer, ajoutez un volume de chambre de protéine myosine-7a humaine purifiée dans un tampon de motilité de chlorure de sodium de 500 millimolaires dans la chambre d’écoulement et incubez-le pendant cinq minutes à température ambiante. Lavez la chambre d’écoulement avec trois volumes de chambre d’un milligramme par millilitre BSA dans un tampon de motilité de chlorure de sodium de 150 millimolaires. Après cela, aspirez le liquide à l’aide d’une lingette propre à la sortie pour absorber l’excès de liquide.
Ensuite, faites couler un volume de chambre de 10 nanomolaires de F-actine marquée à la rhodamine-phalloïdine dans un tampon de motilité de chlorure de sodium de 150 millimolaires à travers la chambre d’écoulement. Surveiller la liaison des filaments d’actine à la surface à l’aide d’un microscope fluorescent avec un objectif 100x. Assurez-vous d’une densité optimale de filaments d’actine pour le suivi, avec suffisamment de filaments dans le champ de vision mais suffisamment clairsemés pour éviter les chevauchements.
Ensuite, lavez la chambre d’écoulement avec trois volumes de chambre de tampon de motilité de chlorure de sodium de 150 millimolaires pour éliminer les filaments d’actine non liés et l’excès de rhodamine-phalloïdine. Pour initier la motilité, ajoutez un volume de chambre du tampon final à la chambre d’écoulement. Ensuite, enregistrez des images sur un microscope à fluorescence en utilisant une excitation de 561 nanomètres pour visualiser l’actine marquée à la rhodamine-phalloïdine.
Trouvez une zone sur la lame avec la densité d’actine souhaitée et capturez des images toutes les 30 secondes pendant 30 minutes. Ensuite, téléchargez et installez le programme Fast à partir du référentiel GitHub. Assurez-vous qu’il s’agit de la version compatible avec Python 3 avec un module supplémentaire pour la conversion de fichiers ND2.
Exécutez le programme Fast en utilisant une valeur de tolérance de 33 pour ne retenir que les filaments en mouvement fluide. Ensuite, utilisez le programme Fast pour analyser les images TIFF nouvellement créées. Définissez la valeur maximale x sur 20 000 nanomètres et la valeur maximale y sur 20 nanomètres par seconde pour représenter la longueur de filament la plus longue et la vitesse maximale du filament.
Ensuite, utilisez px pour définir la taille des pixels de l’image acquise à 65 nanomètres. Réglez minV à 0,1 nanomètre par seconde comme vitesse minimale requise pour l’inclusion du filament dans l’analyse. Pour définir la distance maximale autorisée entre les cadres pour que les filaments soient liés, utilisez maxD, en évitant de lier des filaments séparés entre les cadres.
Utilisez pt pour définir la tolérance aux fluctuations des vitesses des filaments, en incluant uniquement les filaments avec des mouvements réguliers. Enfin, utilisez d pour indiquer le dossier contenant les piles TIFF à analyser. Le test de glissement des filaments d’actine a démontré la motilité lente de la myosine-7a, la lecture vidéo étant accélérée 500 fois pour visualiser le mouvement.
La distribution de vitesse de la myosine-7a a montré un pic inférieur à cinq nanomètres par seconde, confirmant sa motilité lente.
