Pour commencer, prenez des cellules U2OS cultivées avec une confluence de 60 % à 70 % et divisez-les avec 0,25 % de trypsine-EDTA. Préparez des plaques de 60 millimètres en ajoutant des lamelles rondes de 13 millimètres. Plaque 400 000 cellules dans une plaque de 60 millimètres contenant plusieurs lamelles rondes de 13 millimètres.
Ensuite, retirez le milieu de culture des plaques. Ajouter un milieu de culture contenant 25 micromolaires d’étoposide et incuber les cellules pendant 20 minutes, 1 heure et 3 heures. Après l’incubation, retirez le milieu des plaques.
Lavez les cellules avec du PBS trois fois. Pour fixer les cellules, ajoutez du méthanol glacé en quantité suffisante pour couvrir la surface de la lamelle et incubez pendant 10 minutes à 20 degrés Celsius. Ensuite, lavez trois fois les lamelles de recouvrement avec du PBS et transférez-les dans une chambre d’humidité.
Après avoir tapoté le PBS, ajoutez 30 à 40 microlitres de tampon de perméabilisation et incubez pendant 20 minutes à température ambiante. Après cela, lavez les lamelles trois fois avec du PBS. Ensuite, tapotez le PBS des échantillons.
Ajoutez 30 à 40 microlitres de solution de blocage fournie dans le kit PLA à chaque lamelle. Incuber la plaque dans une chambre d’humidité préchauffée à 37 degrés Celsius pendant 1 heure. Diluez maintenant les anticorps primaires dans le diluant d’anticorps fourni dans le kit.
Après avoir tapoté la solution de blocage, ajoutez la solution d’anticorps primaire dans chaque lamelle et incubez à quatre degrés Celsius pendant la nuit dans une chambre d’humidité. Diluez les sondes moins et plus un à cinq dans le diluant d’anticorps. Utilisez des combinaisons comme l’âne anti-souris moins avec l’âne anti-chèvre PLUS et l’âne anti-souris moins avec l’âne anti-lapin PLUS.
Maintenant, tapotez la solution d’anticorps primaire et lavez-la une fois avec du TBST. Après avoir tapoté l’excès de TBST, ajoutez 20 microlitres de solution de sonde PLA sur les lamelles. Ensuite, incubez dans la chambre d’humidité préchauffée à 37 degrés Celsius pendant 1 heure.
Diluez le tampon de ligature 5x dans de l’eau de haute pureté. Tapotez la solution de sonde PLA et lavez-la une fois avec du TBST. Maintenant, ajoutez la ligase à la solution de ligature à une dilution de 1:40 immédiatement avant de l’appliquer sur les échantillons.
Incuber dans la chambre d’humidité préchauffée à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, diluez le tampon d’amplification 5x dans de l’eau de haute pureté. Une fois la solution de ligature retirée des échantillons, lavez les échantillons une fois avec du TBST.
Ajouter la polymérase à la solution d’amplification à des dilutions de 1:80 immédiatement avant de l’appliquer sur les échantillons. Incuber dans la chambre d’humidité préchauffée à 37 degrés Celsius pendant 100 minutes. Tapotez le tampon d’amplification, puis lavez-le deux fois avec le tampon SSC pendant 10 minutes chacun.
Après avoir lavé les échantillons deux fois avec du PBS, ajoutez la solution d’anticorps primaires dans chaque lamelle et incubez à température ambiante pendant 1 heure. À la fin de l’incubation, tapotez la solution d’anticorps primaire et lavez-la trois fois avec du TBST. Ensuite, ajoutez la solution d’anticorps secondaire à chaque lamelle et incubez à température ambiante pendant 20 minutes.
Ensuite, lavez cinq fois avec du TBST, deux fois avec un tampon SSC et deux fois avec un tampon SSC 0,01x. Enfin, acquérez des images de différentes régions de puits ou de lamelles de couverture pour éviter les artefacts dus à une incubation non homogène, et enregistrez tous les canaux avec le même motif de nom.
