Après avoir effectué l’acquisition du point PLA pour localiser l’interaction protéique, ouvrez des images à partir de différentes conditions pour ajuster les paramètres d’analyse dans ImageJ. Déterminez et spécifiez ces paramètres avec les données du programme de macros. Pour supprimer l’arrière-plan, cliquez sur Traiter et soustraire l’arrière-plan.
Utilisez la fonction de prévisualisation pour tester différents rayons de balle roulante. Pour supprimer le bruit, cliquez sur Traiter, Bruit et Désorceler. Cliquez ensuite sur Traiter et lisser dans le menu du noyau pour appliquer la fonction de lissage et améliorer le remplissage.
Maintenant, cliquez sur Image, puis sur Type, et sélectionnez 8 bits pour convertir en image 8 bits. Après cela, ajustez le seuil en accédant à Image, Ajuster, et enfin, Seuil. Ajustez le seuil pour visualiser tous les noyaux ou points de l’image, tout en évitant la sursaturation et l’effondrement des structures.
Notez également les valeurs et testez dans différentes images. Pour convertir en masque, cliquez sur Traiter, Binaire et Convertir en masque. Pour le noyau, cliquez sur Processus, Binaire et Remplir les trous, puis sur Processus, Binaire et Bassin versant.
Pour les points PLA, cliquez sur Traiter, Binaire et Bassin versant. Pour compter les noyaux, mesurez l’aire ou la longueur des différents noyaux afin d’estimer la taille moyenne. Utilisez une valeur approximative pour analyser les particules en cliquant sur Analyser et Analyser les particules.
Réglez la taille sur 15 infini et vérifiez les options. Afficher le masque, afficher les résultats, effacer les résultats, ajouter au gestionnaire et exclure sur les bords. Pour compter les points PLA, mesurez leur aire ou leur rayon afin d’estimer leur taille moyenne.
Pour chaque retour sur investissement dans le gestionnaire de retour sur investissement, cliquez sur Analyser et Analyser les particules. Réglez la taille sur 0,02 à 3. Cochez les options, afficher le masque, afficher les résultats, effacer les résultats, résumer et exclure sur les bords.
Enregistrez les résultats en indiquant le nombre de points par noyau dans chaque noyau présent dans l’image. L’interaction Nek4 Ku70 a augmenté dans le noyau après des dommages à l’ADN après 20 minutes, une heure et trois heures de traitement à l’étoposide par rapport aux cellules témoins et traitées au DMSO. Le traitement à l’étoposide a significativement augmenté l’interaction de la topoisomérase Nek5 2-bêta par rapport au témoin DMSO.
La coloration gamma-H2AX a augmenté après 20 minutes de traitement à l’étoposide et est restée élevée jusqu’à trois heures, indiquant une réponse soutenue aux dommages à l’ADN.
