Pour commencer, générez des assembloïdes marqués par un virus à l’aide d’organoïdes cérébraux spécifiques au destin. Pour préparer les réactifs pour le prétraitement de surface MEA, dissolvez 0,5 gramme de poudre d’enzyme détergente dans 50 millilitres d’eau déminéralisée. Agitez soigneusement le mélange jusqu’à ce que la poudre soit complètement dissoute et stérilisez la solution à l’aide d’un filtre sous vide supérieur à tube stérile à l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique.
Diluez 500 microlitres de la solution mère de polyéthylénimine à 7 % ou PEI avec 49,5 millilitres de tampon de borate 1X pour préparer une solution à 0,07 % PEI. Pour stériliser la solution, filtrez-la à travers une unité de filtration de 0,22 micromètre à l’intérieur de l’enceinte de biosécurité. Ensuite, versez un millilitre de la solution enzymatique détergente à 1 % dans chaque puits d’une plaque MEA stérile et incubez-la à 37 degrés Celsius pendant deux heures.
Retirez ensuite la solution enzymatique détergente de chaque puits et lavez les puits cinq fois avec 1,5 millilitre d’eau déminéralisée stérile par puits. Remplissez chaque puits avec un millilitre de milieu de culture pour le préconditionnement. Remettez les plaques MEA dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant deux jours.
Après l’incubation, retirez le milieu de culture des puits et ajoutez 50 microlitres de solution PEI à 0,07 % pour couvrir les électrodes MEA pour le revêtement primaire. Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, aspirez complètement la solution PEI de chaque puits.
Lavez chaque puits trois fois avec un millilitre d’eau déminéralisée stérile. Après avoir aspiré l’eau, séchez les plaques à température ambiante pendant 15 minutes dans l’enceinte de biosécurité avec le couvercle ouvert. Couvrez maintenant la zone de l’électrode dans chaque puits avec 50 microlitres de une à 20 matrice de membrane basale volume à volume diluée dans un milieu de culture pour un revêtement secondaire.
Remettez les plaques MEA dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, aspirez la solution matricielle diluée en laissant une fine couche à la surface. En cas de formation d’une couche épaisse, vaporisez avec force la zone de contact de l’électrode avec un milieu de culture à l’aide d’une pointe de pipette P1000.
Ensuite, à l’aide d’une pointe P1000 avec une coupe large, prélevez un assembloïde de la boîte et placez-le soigneusement sur les électrodes dans un puits tout en transférant le moins de fluide possible. Placez la plaque sous un microscope de dissection dans une hotte à flux laminaire et, à l’aide d’une pointe P 20 stérile, poussez soigneusement l’assembloïde à l’endroit souhaité. À l’aide d’un embout P 20, enlever l’excès de liquide autour de l’assembloïde.
Après l’incubation, retirez la plaque de l’incubateur. Ensuite, en observant au microscope de dissection, appliquez deux à trois petites gouttes d’une à 50 matrices de membrane basale diluées dans un milieu de culture sur les assembloïdes, et remettez la plaque dans l’incubateur pendant 30 minutes supplémentaires. Ensuite, ajoutez soigneusement trois gouttes de milieu de culture près des assembloïdes à l’aide d’un microscope à dissection.
Le lendemain, vérifiez si les assembloïdes se sont stabilisés et stabilisés au microscope de dissection. Ajoutez 750 microlitres de milieu de culture pour porter le volume total à un millilitre par puits et laissez la plaque intacte pendant au moins deux jours dans l’incubateur. Chaque semaine, retirez soigneusement 500 microlitres de milieu de culture de chaque puits et introduisez 700 microlitres de milieu de base neurophysiologique frais dans chaque puits.
Une augmentation de la durée de l’éclatement du réseau a été observée le jour 92 par rapport au jour 78, probablement en raison de la maturation des neurones. L’activité cellulaire et réseau s’est lentement estompée au jour 125.
