La technique que nous présentons aujourd’hui permet d’analyser l’activité des neurones de la moelle épinière en raison du facteur neuronal intrinsèque et de l’influence des astrocytes environnants. Cette technique génère de manière fiable à la fois des neurones humains et des astrocytes humains spécifiques à la moelle épinière et utilise une mesure de sortie fonctionnelle qui peut être mise à l’échelle pour la reproductibilité. La technique que nous présentons permet d’étudier des maladies spécifiques aux neurones de la moelle épinière telles que la sclérose latérale amyotrophique, en utilisant des neurones de patients atteints de maladies sporadiques ou génétiques.
Pour commencer, examinez les plaques iPSC humaines pour détecter les colonies suffisamment denses de sorte que le centre des colonies présente des zones blanches dispersées. Ensuite, pour commencer à emballer les cellules, tracez des lignes de grille sur la surface extérieure inférieure des plaques avec un marqueur pour faciliter une couverture précise de l’ensemble de la plaque. Utilisez un microscope à contraste de phase d’un grossissement de 10x dans une hotte de culture pour détacher les colonies différenciées en grattant manuellement avec une pointe de pipette de 200 microlitres.
Ensuite, rincez les assiettes deux fois avec du PBS. Et puis ajoutez cinq millilitres de protéase de dissociation tissulaire préchauffée à 37 degrés Celsius. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant quatre à sept minutes jusqu’à ce que les bords des colonies commencent à s’arrondir, avant de soulever les colonies de la plaque.
Aspirer soigneusement la protéase de dissociation et rincer doucement la plaque deux fois avec du PBS sans déloger les colonies. Ajouter cinq millilitres de milieu iPSC humain préchauffé à la plaque de culture. Ensuite, grattez toute la plaque avec la pointe d’une pipette de cinq millilitres en effectuant un mouvement de va-et-vient de haut en bas et soulevez les colonies tout en les divisant en agrégats cellulaires plus petits.
Pour la différenciation des CSPi humaines en cellules progénitrices neurales. Une fois que l’iPSC humain forme une monocouche et devient confluent à 90%, commencez la différenciation comme décrit dans le manuscrit. Le 12ème jour, après le traitement à la trypsine, si les cellules ne sont pas en suspension, détachez mécaniquement les cellules en éjectant le milieu d’induction neurale d’une pointe de pipette de 1000 microlitres sur les cellules avec un mouvement circulaire pour couvrir toute la surface.
Si les cultures de cellules progénitrices neurales ont été congelées, décongelez-les. Après échange de milieu et rinçage PBS comme décrit dans le manuscrit, changer le milieu avec un milieu de différenciation des motoneurones contenant 0,02 cytosine arabinoside micromolaire, puis incuber les cellules pendant 48 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone lorsque les progéniteurs engagés gliaux émergent sous forme de cellules plates proliférantes uniques sous des progéniteurs de motoneurones post-mitotiques, agrégés en grappes de cellules. Plus tard, effectué un échange médium comme indiqué dans le manuscrit.
Le jour du placage ou avant, commencez à enduire les plaques MEA de 24 puits en diluant d’abord le PLO dans de l’eau ou du PBS. Ajoutez ensuite 15 à 20 microlitres de PLO à chaque puits formant une gouttelette au centre du puits, couvrant la zone de l’électrode en veillant à ne pas endommager les électrodes avec l’extrémité de la pipette. Ajoutez de l’eau dans les compartiments entourant les puits, en assurant une humidité suffisante.
Et incuber l’OLP à 37 degrés Celsius pendant une à deux heures. Ensuite, à l’aide d’une pointe de micro-pipette en plastique, aspirez autant de PLO que possible sans toucher les électrodes. Ensuite, lavez le puits avec 250 microlitres d’eau trois fois.
À l’aide d’une pointe de pipette, retirez autant d’eau que possible et laissez la surface sécher avec le couvercle retiré. Ensuite, ajoutez 15 à 20 microlitres de laminine diluée pour couvrir chaque réseau d’électrodes. Après avoir ajouté de l’eau dans les compartiments d’humidité et remplacé le couvercle, incuber à 37 degrés Celsius pendant au moins deux heures jusqu’à la nuit.
Le jour du placage, après avoir rincé les motoneurones et les cultures d’astrocytes une fois avec du PBS, ajoutez 0,05% de trypsine et incuber à 37 degrés Celsius pendant environ cinq minutes pour soulever les cellules. Recueillir les cellules dans un tube conique de 15 millilitres contenant un inhibiteur de trypsine. Et laver les plaques avec un milieu ou une base pour s’assurer que toutes les cellules sont collectées.
Enduire les cellules par centrification. Ensuite, à l’aide d’une pipette de 1000 microlitres, remettez en suspension les motoneurones et les astrocytes avec un milieu de co-culture contenant 20 micromolaires d’inhibiteur de ROCK pour générer un millilitre d’une suspension unicellulaire. À l’aide d’un hémocytomètre, comptez les motoneurones et les astrocytes.
Et pendant le comptage, conservez les suspensions cellulaires et placez-les dans un support en polystyrène à quatre degrés Celsius. Centrifuger un millilitre des suspensions cellulaires à 300 fois G pendant cinq minutes. Calculez le volume souhaité et remettez les granulés en suspension.
Combinez le volume requis de suspensions de neurones et d’astrocytes dans des proportions égales, et mélangez doucement en pipetant deux fois pour bien combiner. Ensuite, retirez la laminine de chaque puits de la plaque et transférez 10 microlitres de la suspension cellulaire combinée finale à chaque puits, formant une petite gouttelette recouvrant le réseau d’électrodes. Incuber les plaques avec une gouttelette cellulaire non perturbée à 37 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes pour former des attaches initiales sur les plaques.
Ensuite, pipeter 250 microlitres de milieux de coculture chauds contenant un inhibiteur de ROCK sur la paroi de chaque puits et pipeter le même volume sur la paroi opposée de chaque puits et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 24 à 36 heures. Le lendemain, examinez les plaques à la recherche de débris ou de cellules mortes. Et si nécessaire, échangez le milieu avec un milieu de co-culture frais contenant un inhibiteur de ROCK.
Sinon, effectuez des échanges demi-milieu deux fois par semaine en utilisant un milieu de co-culture sans inhibiteur de ROCK à partir du deuxième jour de co-culture. Pour effectuer l’enregistrement, commencez dès que possible après le premier jour de la co-culture en réglant la température à 37 degrés Celsius et le dioxyde de carbone à 5%, puis transférez les plaques sur la machine d’enregistrement et équilibrez pendant au moins cinq minutes avant l’enregistrement. Enregistrer l’activité de base tous les deux jours ou toutes les semaines pendant une à 15 minutes selon le plan expérimental.
Pour étudier les effets électrophysiologiques transitoires des composés ciblant les neurones ou les astrocytes, retirez le couvercle de la plaque, mais maintenez le couvercle de la machine fermé et enregistrez l’activité de base pendant au moins une minute. Ouvrez manuellement le couvercle de la machine sans arrêter l’enregistrement électrophysiologique et échangez 25 microlitres de milieu avec le véhicule médicamenteux approprié. Fermez ensuite le couvercle manuellement et enregistrez pendant des minutes supplémentaires si nécessaire.
De même, testez le médicament d’intérêt. Dans ce protocole, les CSPhi ont été maintenues et passées en tant que colonies non confluentes. La neurogenèse a été initiée par une double inhibition SMAD en inactivant les voies BMP et TGF-bêta.
Les cellules souches neuroépithéliales résultantes se sont divisées et ont généré un épithélium multicouche. L’exposition précoce à des facteurs de croissance neuronale et à un facteur neurotrophique ciliaire gliogène a généré une population mixte de cellules progénitrices. Les neurones ont émergé spontanément de cette population mixte.
Le commutateur gliogène a induit la différenciation des astrocytes par l’activation de la voie JAK-STAT. L’identité de la moelle épinière des cellules de motoneurones traitées par inhibiteur d’encoche et différenciées était soutenue par des niveaux élevés d’expression de choline acétyltransférase. Le 90e jour après la culture in vitro, les astrocytes iPSC humains présentaient un phénotype en cours de maturation, comme indiqué par l’expression bêta S100 et GFAP, tandis que leur identité régionale de la moelle épinière était soutenue par l’expression des faucons auparavant.
Les cellules co-cultivées se sont réarrangées spontanément avec des astrocytes créant une couche d’alimentation en bas et des neurones reliant des réseaux en haut. Les neurones se sont agrégés en grands amas cellulaires lorsqu’ils étaient cultivés seuls, tandis que la co-culture de motoneurones iPSC humains avec des astrocytes iPSC humains a donné lieu à des monocouches uniformément distribuées. Les astrocytes iPSC humains ont amélioré la maturation électrophysiologique des motoneurones iPSC humains, comme le montrent des degrés plus élevés d’activité de pointe et d’éclatement dans les co-cultures.
D’après notre expérience, la culture de cellules souches et la différenciation précoce des NPC sont les plus difficiles et les plus sensibles aux erreurs techniques. À ce stade, les techniques ne doivent pas être exécutées avec cohérence et précision avec peu de marge de dépannement. Les techniques de co-culture décrites ici peuvent également être utilisées dans d’autres modèles spécifiques à un type de cellule.
