Le financement de ce travail a été fourni par une croissance Iowa Fonds du Prix Valeurs à BFBS.

1. L&#39;échantillonnage de surface avec du ruban adhésif stérile <ol><li> Sélectionnez une bande à utiliser pour l&#39;échantillonnage. Le commerce des champignons-Tape ou Con-Tact-Il bandes d&#39;échantillonnage sont stériles et spécialement conditionnés pour la facilité d&#39;utilisation. Toutefois, nous avons constaté que la transparence (optiquement clair) de bandes de bureau génériques peuvent également être utilisés. </li><li> Utilisez un marqueur indélébile pour dessiner des carrés de 1 cm 2 sur le côté non collant d&#39;un morceau de 10 cm de ruban adhésif (un modèle de papier peuvent être utilisés). Cela servira de guide visuel pour noter quelle portion de la bande a été utilisée pour l&#39;échantillon de la surface des aliments ou l&#39;environnement. </li><li> Former un «C» en forme de boucle de ruban, avec le côté collant face à la surface à échantillonner. Pour ce faire, tenir les extrémités collantes avec le pouce et le majeur et l&#39;index de position contre le carré dessiné sur le dos (non collante côté) de la bande (figure 1). </li><li> Placez le ruban sur la surface à échantillonner et appuyez doucement sur la zone marquée sur la surface. Sans relâcher les bords de la bande, utiliser l&#39;index pour s&#39;assurer que le côté collant de la bande vient en plein contact avec la surface de l&#39;échantillon, en évitant les bulles. </li><li> Avec un mouvement même, tirez lentement le ruban loin de l&#39;échantillon, à extraire physiquement liée à la surface des microbes. Fixez la bande de cellules chargées, côté collant en haut, sur une lame de microscope en verre à l&#39;aide de bandes de bureau générique transparente. Assurer une bonne tension / étirement de la bande de sorte que d&#39;un appartement, non ridée surface est créée. Cela aidera à minimiser les problèmes de déformation / curling de la bande pendant le chauffage subséquente au cours de l&#39;hybridation. </li></ol> 2. En phase solide d&#39;enrichissement et Miniculture surface liquide <ol><li> Solid-phase d&#39;enrichissement est réalisé en plaçant le ruban à plat ventre sur le xylose-lysine-Tergitol 4 (XLT-4) des plaques d&#39;agar de sorte que les cellules prélevées sont mises en contact direct avec la surface de la gélose. La portion de contact basés sur des modèles / échantillon de la bande est placée au ras de la surface de la gélose et une extrémité de la bande est lâche adhéré à la paroi latérale de la boîte de Pétri pour faciliter le retrait facile de la bande de la surface de la gélose après enrichissement. </li><li> Les plaques sont inversés (pour éviter la condensation) et incubées à 35 - 37 ° C pour permettre une croissance suffisante de Salmonella spp. La longueur de la période d&#39;incubation nécessaire pour enrichir les cellules à un niveau détectable dépendra niveaux initiaux de contamination par Salmonella. Nous avons observé la formation de microcolonies excellente inoculums initial faible après 8 h d&#39;enrichissement. </li><li> Après la période d&#39;enrichissement désiré, ouvrez la plaque de gélose. La bande conserve son adhésivité pendant l&#39;incubation. Appuyez doucement sur le ruban contre la gélose en utilisant l&#39;index pour assurer une récupération maximale de microcolonies formée à l&#39;interface ruban-agar. Saisir la bande du bord attaché à la paroi de la boîte de Petri et de l&#39;enlever avec une lenteur, même le mouvement. Montez la bande cellule chargée, côté collant en haut, sur une lame de microscope comme décrit dans la section 1.5 ci-dessus. Passez à «Fixation et déshydratation&quot; étape ci-dessous. </li><li> Pour miniculture surface du liquide, commencez par la fixation de la bande utilisée pour l&#39;échantillonnage sur une lame de microscope comme décrit dans la section 1.5 ci-dessus. Ensuite, couvrir la partie de contact basés sur des modèles / échantillon de la bande avec une chambre non stérile en silicone perfusion (Coverwell, Grace Bio-Labs, Inc), formant une enceinte hermétique dont le fond est composé de la bande de cellules chargées, vers le haut. Fermement, mais appuyez doucement sur la chambre en place pour assurer un joint étanche. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un gel souple de chargement pointe de la pipette, transférer ≤ 500 uL de bouillon trypticase-soja ou tout autre support approprié d&#39;enrichissement par l&#39;un des ports de la chambre petite crique. Joint deux ports avec du ruban adhésif transparent pour éviter de bureau diapositives évaporation et incuber à 35 -37 ° C selon les besoins d&#39;enrichissement suffisant. Bien que toutes les opérations devraient être effectuées conformément aux bonnes pratiques d&#39;échantillonnage et la manutention, la stérilité de Port-ruban d&#39;étanchéité ou de chambres de perfusion n&#39;est pas nécessaire lors de miniculture surface du liquide. La combinaison de la FISH et cytométrie en flux permettra une discrimination claire de Salmonella spp. à partir de bactéries non-cibles qui peuvent être présents, avec la plus grande contribution des non-cibles flore devrait provenir de l&#39;échantillon lui-même. Passez à «Fixation et déshydratation&quot; étape ci-dessous. </li></ol> 3. Fixation et déshydratation <ol><li> Pour l&#39;échantillonnage de surface directe ou pour l&#39;enrichissement en phase solide de Salmonella spp. pour XLT-4 agar, effectuer la fixation des cellules sur cassette pendant 30 min à 25 ° C en couvrant la surface de contact de l&#39;échantillon avec 500 ul de 10% du formol tamponné neutre. </li><li> Jeter fixateur dans un récipient hermétique (sous une hotte chimique pour réduire l&#39;exposition aux irritants / vapeurs toxiques). </li><li> Déshydrater dans une série d&#39;éthanol (50%, 80% et 95%; 300 pl / 3 min de chaque concentration). Passez à &quot;hybridation&quot; étape ci-dessous. </li><li> Pour la fixation d&#39;échantillon de 500 uL surface liquide minicultures, des chambres de perfusion sont descellés, et une flexibilité de chargement de gel pointe de la pipette est utilisée pour extraire l&#39;enrichate. Pipetage rapide de haut en bas est utilisé pour aider à assurer l&#39;élimination effective de toute restantes bande liée cellules. </li><li> Ensuite, l&#39;ensemble du volume de 500 uL miniculture est transféré à un tube de centrifugation et centrifugés à 2000 xg (5 min). Le surnageant est éliminé, le culot est vortexé vigoureusement pendant 30-60 s, puis remis en suspension dans un volume égal de 10% du formol tamponné neutre. Les cellules sont fixées pendant 30 min à 25 ° C. </li><li> Ensuite, fixateur est enlevé et l&#39;échantillon est remis en suspension dans un tampon de stockage des cellules, comme suit. L&#39;échantillon est centrifugé à 2000 xg (5 min, 25 ° C) le surnageant est éliminé, le culot est vortexé vigoureusement pendant 30 - 60 s, la remise en suspension dans un volume égal de 50% éthanol non dénaturé-50% de phosphate une solution saline tamponnée. Les cellules fixées peuvent être stockées indéfiniment (ans) à -20 ° C. Note: Lorsque des liquides sont modifiées (par exemple, lorsque l&#39;introduction d&#39;un tampon de fixatif ou autre), il est important de bien resuspendre (avec vortex) de la cellule dans une partie minime de pellets (~ 10 - 20 pl) du système liquide &quot;sortants&quot; . Cela aidera à empêcher l&#39;agglutination et d&#39;assurer que les suspensions, même des cellules individuelles sont obtenues. Passez à &quot;hybridation&quot; étape ci-dessous. </li></ol> 4. Hybridation <ol><li> Préparer hybridation / tampon de lavage en utilisant les commerciaux de biologie moléculaire de qualité des solutions noté dans le tableau des matériaux. Concentrations finales composant tampon de 0,7 M de NaCl, 0,1 M Tris [pH 8,0], EDTA 10 mM, du sulfate de sodium à 0,1% dodécyle, constitué au volume final désiré avec moléculaires de qualité de l&#39;eau et filtré à l&#39;aide d&#39;une seringue de 0,22 um ou le filtre coupe. Le même tampon, sans l&#39;ajout de sondes (voir ci-dessous) est utilisé comme un tampon de lavage. Préchauffer l&#39;hybridation et le lavage tampons à 55 ° C. </li><li> Ajouter marqués à la fluorescence Sal3 (Nordentoft et al, 1997;. 5&#39;-AAT CAC GTG TTC ACC TAC-3 &#39;) et de la Salm-63 (Kutter et al, 2006;. 5&#39;-TCG ACT GAC TTC AGC TCC-3&#39; ) des sondes oligonucléotidiques (Tableau Matériaux) au tampon d&#39;hybridation préchauffé. Une concentration totale de la sonde de 5 pl ng -1 est utilisée (par exemple 2,5 ng -1 uL chaque sonde; Bisha et Brehm-Stecher, 2009a). </li><li> Pour direct-to-bande et l&#39;enrichissement des échantillons solides de phase, la superposition de la zone de l&#39;échantillon modélisé de contact de la bande avec 300 ul de tampon d&#39;hybridation contenant la sonde et cocktail de s&#39;hybrider bandes lié cellules dans un milieu humide, chambre d&#39;incubation étanche fixé à 55 ° C. Si un incubateur à contact direct, comme l&#39;instrument Moat Slide (Tableau Matériaux) est utilisée, les échantillons sont hybridées pendant 15 min et&gt; 20 diapositives peuvent être traitées simultanément. Si un four à hybridation rotatif de style telles que l&#39;instrument Bambino (Tableau Matériaux) est utilisé, les lames sont placées dans des tubes de centrifugeuse de 50 ml en polypropylène pour l&#39;hybridation, une diapositive par tube. Parce que le transfert de chaleur n&#39;est pas direct, ces échantillons sont hybridées pour de plus longues périodes (jusqu&#39;à 30 min). </li><li> Après l&#39;hybridation, les lames sont retirés et la sonde contenant superposition tampon d&#39;hybridation est éliminé. Les lames sont ensuite soit brièvement et doucement rincée avec un tampon de lavage préchauffée par pipetage un petit volume de tampon sur une lame inclinée (3 rinçages de 300 uL de chaque), ou officiellement lavés (jusqu&#39;à 30 min) avec soit une superposition de tampon de lavage préchauffé ou immersion dans un tube à centrifuger en polypropylène de 50 ml contenant du tampon de lavage préchauffé. Dans notre expérience, même si un lavage régulier et offre une amélioration des résultats (moins brume de la sonde non liée), un simple rinçage est suffisante pour la détection sans ambiguïté de Salmonella spp. Ensuite, les lames sont séchées à l&#39;air avant de passer à la &quot;détection&quot; étape ci-dessous. </li><li> L&#39;hybridation des échantillons de liquide de surface miniculture est effectuée par le bas filer des échantillons (fraîchement fixe ou conservés dans un tampon de stockage à -20 ° C) pendant 5 min à 2000 xg, suivi par vortex vigoureux de la pastille et la remise en suspension dans 100 uL de tampon d&#39;hybridation préchauffé contenant le cocktail de la sonde. Les échantillons sont hybridées à 55 ° C pendant 30 min sur un bloc de chaleur ou d&#39;autres station d&#39;incubation approprié (Tableau Matériaux), suivie par l&#39;addition de 500 uL de tampon de lavage préchauffé. Comme avec du ruban lié échantillons, ces échantillons peuvent être officiellement lavés pour un maximum de 30 min avec une nouvelle incubation à 55 ° C dans ce tampon de lavage, avec vortex intermittente. Alternativement, les échantillons peuvent être soigneusement vortexés après ajout de 500 uL de tampon de lavage préchauffé, suivie par une récolte immédiate pour l&#39;analyse (ci-dessous). </li><li> En préparation pour la détection de Salmonella spp. par cytométrie en flux, liquide des échantillons de surface sont miniculture centrifugés à 2000 xg pendant 5 min, le surnageant est éliminé et les échantillons sont remis en suspension dans 300 uL température ambiante (~ 25 ° C) PBS. Si les échantillons nécessitent un transport vers une installation éloignée, ou si un délai est prévu entre l&#39;hybridation et l&#39;analyse, les échantillons peuvent être réfrigérés ou détenus sur la glace avant d&#39;Analyse. Alternativement, les échantillons peuvent être transférés à la cellule de stockage tampon (50:50 mélange de PBS et de l&#39;éthanol absolu) et maintenue à -20 ° C jusqu&#39;à une semaine sans perte appréciable de sonde sont conférés par fluorescence (Bisha et Brehm-Stecher, 2009b) . </li></ol> 5. Détection <ol><li> Pour le bande de détection de Salmonella spp. par microscopie à fluorescence, direct-to-tape ou solides des échantillons d&#39;enrichissement de phase sont recouvertes de 10 uL ~ Vectashield H-1200 contenant le milieu de montage nucléaires Contre 4 &#39;,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), monté avec une lamelle, puis incubés dans l&#39;obscurité pendant 10 min. </li><li> Huile à immersion est placé sur la lamelle, et les échantillons sont examinés à l&#39;aide d&#39;un objectif de pétrole à fort grossissement (63x ou 100x). Le filtre DAPI est utilisé pour amener l&#39;échantillon dans le foyer, le microscope est ensuite commuté sur le filtre approprié (vert ou rouge, selon le colorant utilisé pour mettre fin à l&#39;étiquette des sondes) et les cellules de Salmonella sont marqués visuellement selon leur fluorescence (Figures 2 et 3). </li><li> Pour la détection par cytométrie de liquide échantillons miniculture surface, divers instruments peuvent être utilisés, selon les disponibilités locales. Dans notre laboratoire, PBS-suspendus échantillons sont transférés dans des tubes 5 ml à fond rond d&#39;échantillonnage (BD Falcon) et examiné en utilisant un cytomètre en flux FACSCanto avec une excitation à 647 nm (Tableau Matériaux). Pour les échantillons enrichis contenant un nombre élevé de bactéries totales, le &quot;faible débit&quot; de réglage (10 min uL -1) est utilisé et 5,000-50,000 événements sont collectés. Les données sont analysées à l&#39;aide FlowJo logiciel (version 8.8.6, Arbre Star, Inc, Ashland, OR) ou d&#39;autres logiciels d&#39;analyse approprié (voir la figure 4, panneaux A et B). </li></ol> 6. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Utilisez du ruban adhésif pour l&#39;échantillonnage de Salmonella spp. de la surface d&#39;une tomate artificiellement contaminés. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Les résultats typiques pour direct-to-tape d&#39;échantillonnage et de détection du poisson de Salmonella Typhimurium ATCC 14028 de la surface de la tomate (100 objectifs du pétrole X). Un cocktail de deux sondes de Texas Red sondes marquées (Sal3/Salm-63) a été utilisée d&#39;étiqueter ces cellules. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Microcolonies de Salmonella Typhimurium ATCC 14028 formée sur la surface de xylose lysine Tergitol-4 (XLT-4) gélose après une h 8 sur cassette d&#39;enrichissement à 37 ° C. L&#39;inoculum initial a été échantillonnée à partir de la surface d&#39;une tomate artificiellement contaminés. Solid-phase d&#39;enrichissement augmente le nombre de cellules disponibles pour la détection et améliore également le contenu cellulaire ARNr. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Utilisez du ruban adhésif pour l&#39;échantillonnage de S. enterica sérotype Typhimurium de la surface d&#39;une tomate artificiellement contaminés, suivie par l&#39;analyse directe via FISH et cytométrie en flux (panneau A) ou après 5 h d&#39;enrichissement non-sélectif surface liquide miniculture dans une chambre de perfusion remplie avec 500 pi de bouillon trypticase-soja (panneau B ).

<ol>
	<li>Almeida, C., Azevedo, N. F., Fernandes, R. M., Keevil, C. W., Vieira, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+method+using+a+peptide+nucleic+acid+probe+for+the+identification+of+Salmonella+spp.+in+a+broad+spectrum+of+samples.">Fluorescence in situ hybridization method using a peptide nucleic acid probe for the identification of Salmonella spp. in a broad spectrum of samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 4476-4485 (2010).</li><li>Barnetson, R. S., Milne, L. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+sampling+for+Candida+with+adhesive+tape.">Skin sampling for Candida with adhesive tape.</a> Br. J. Dermatol. 88, 487-491 (1973).</li><li>Bisha, B., Brehm-Stecher, B. 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Des méthodes simples et rapides pour la détection des pathogènes sur des surfaces de produire peut aider à atténuer les maladies d&#39;origine alimentaire en fournissant des données pertinentes et appropriées. Adhésif méthodes d&#39;échantillonnage basés sur la cassette ont été utilisés dans l&#39;environnement, clinique et de microbiologie alimentaire depuis les années 1950 et impliquent appuyant sur &quot;Scotch&quot; style de bande à des surfaces pour l&#39;élimination des microorganismes, suivi par ...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fungi-Tape sampling tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific Device Laboratory, Des Plaines, IL</td>
<td>745</td>
<td>http://www.scientificdevice.com/</td>
</tr>
<tr>
<td>Con-Tact-It sampling tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Birko Corporation, Denver, CO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>http://www.birkocorp.com/</td>
</tr>
<tr>
<td>Clear office tape, generic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence</td>
</tr>
<tr>
<td>Food surface</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Local grocery</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tomatoes (red tomatoes on the vine, not waxed or oiled) used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypticase Soy Broth</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco, Sparks, MD</td>
<td>211768</td>
<td>For non-selective liquid surface miniculture enrichment</td>
</tr>
<tr>
<td>Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco, Sparks, MD</td>
<td>223420</td>
<td>For Salmonella-selective agar (XLT-4)</td>
</tr>
<tr>
<td>Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco, Sparks, MD</td>
<td>235310</td>
<td>For Salmonella-selective agar (XLT-4)</td>
</tr>
<tr>
<td>Formalin solution </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>HT5011</td>
<td>10% solution, neutral, buffered (cell fixative)</td>
</tr>
<tr>
<td>Absolute ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>E7023</td>
<td>Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration)</td>
</tr>
<tr>
<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>RNase- and DNase-free</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope slides and cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>S5150</td>
<td>Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component)</td>
</tr>
<tr>
<td>Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>T9285</td>
<td>1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component)</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium dodecyl sulfate solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>L4522</td>
<td>10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component)</td>
</tr>
<tr>
<td>Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Integrated DNA Technologies, Coralville, IA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5&#x2019;-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified</td>
</tr>
<tr>
<td>Variable speed microcentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>CoverWell perfusion chamber </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grace Bio-Labs Inc., Bend, OR</td>
<td>PC1R-2.0</td>
<td>Non-sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>Gel loading pipette tips (FS MultiFlex)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
<td>05-408-151</td>
<td>Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber</td>
</tr>
<tr>
<td>Aluminum heat block or precision-controlled heating station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Bambino mini hybridization oven</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Boekel Scientific, Feasterville, PA</td>
<td>Model 230300</td>
<td>Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct</td>
</tr>
<tr>
<td>Slide Moat slide hybridizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Boekel Scientific, Feasterville, PA</td>
<td>Model 240000</td>
<td>Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide</td>
</tr>
<tr>
<td>Vectashield H-1200 mounting medium with 4&#x2019;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td>
<td>H-1200</td>
<td>Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescence microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leitz Laborlux S used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Digital camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Canon PowerShot A640 camera used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Image acquisition software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used</td>
</tr>
<tr>
<td>Adobe Photoshop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Adobe Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels)</td>
</tr>
<tr>
<td>Flow cytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used</td>
</tr>
<tr>
<td>Flow cytometry analysis software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

combination of adhesive-tape-based sampling and fluorescence in situ hybridization for rapid detection of salmonella on fresh produce

Ce protocole décrit une méthode simple pour les adhésifs à base de bandes d&#39;échantillonnage de tomate et d&#39;autres surfaces de produits frais, suivi par le bande hybridation fluorescente in situ (FISH) pour rapidement indépendante de la culture de détection de Salmonella spp. Cell-bandes chargées peuvent également être placées face cachée sur une gélose sélective pour l&#39;enrichissement en phase solide avant la détection. Alternativement, les enrichissements de liquide de faible volume (miniculture surface du liquide) peut être effectuée sur la surface de la bande dans un bouillon non sélectif, suivis par les poissons et l&#39;analyse par cytométrie en flux. Pour commencer, ruban adhésif stérile est mis en contact avec des produits frais, une légère pression est appliquée, et la cassette est retirée, extraire physiquement les microbes présents sur ces surfaces. Les bandes sont montées collant vers le haut sur des lames de microscope en verre et les cellules prélevées sont fixés avec du formol à 10% (30 min) et déshydratés à l&#39;aide d&#39;une série d&#39;éthanol à (50, 80 et 95%; 3 min de chaque concentration). Ensuite, la cellule chargée des bandes sont repérés avec le tampon contenant un cocktail de Salmonella ciblées sonde ADN et hybrides pour les 15 - 30 min à 55 ° C, suivi par un bref rinçage dans un tampon de lavage pour enlever la sonde non liée. Adhérents, FISH cellules marquées sont ensuite contre-colorées avec de l&#39;ADN de teinture 4 &#39;,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et les résultats sont considérés en utilisant la microscopie à fluorescence. Pour en phase solide enrichissement, la cellule chargée des bandes sont placées face cachée sur une surface de gélose sélective adaptés et mis en incubation pour permettre la croissance in situ des microcolonies Salmonella, suivis par les poissons et la microscopie comme décrit ci-dessus. Pour miniculture surface du liquide, la cellule chargée des bandes sont placées côté collant et une chambre de perfusion de silicone est appliqué de telle sorte que le ruban et la forme de la lame de microscope fond d&#39;une chambre étanche dans laquelle un petit volume (≤ 500 pi) de trypticase soja Bouillon (BST) est introduit. Les ports d&#39;entrée sont fermées et les chambres sont incubées à 35 - 37 ° C, permettant une croissance basée sur l&#39;amplification de la bande-extrait de microbes. Après incubation, les ports d&#39;entrée sont descellés, les cellules sont détachées et mélangées avec le dos vigoureuse-et-vient de pipetage, récolté par centrifugation et fixés dans 10% du formol tamponné neutre. Enfin, les échantillons sont hybridés et examiné par cytométrie en flux pour révéler la présence de Salmonella spp. Comme il est décrit ici, notre &quot;bande-FISH» approche peut fournir d&#39;échantillonnage simple et rapide et la détection de Salmonella sur des surfaces de tomates. Nous avons également utilisé cette approche pour l&#39;échantillonnage d&#39;autres types de produits frais, y compris les épinards et les piments jalapeño.

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Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Ce protocole décrit un simple adhésif à base de bandes approche pour l&#39;échantillonnage de tomate et d&#39;autres surfaces de produits frais, suivie d&#39;une détection rapide des cellules de l&#39;ensemble du<em&gt; Salmonella</em&gt; En utilisant la fluorescence<em&gt; In situ</emL&#39;hybridation&gt; (FISH).

Combinaison de adhésif à base de bandes d&#39;échantillonnage et de fluorescence In situ</emHybridation> pour la détection rapide des Salmonella Sur les produits frais

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

combination-adhesive-tape-based-sampling-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

12.9K vues.  Colorado State University. Ce protocole décrit un simple adhésif à base de bandes approche pour l'échantillonnage de tomate et d'autres surfaces de produits frais, suivie d'une détection rapide des cellules de l'ensemble du Salmonella En utilisant la fluorescence In situ

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Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular environment. In order to increase throughput, FISH can be combined with flow cytometry (flow-FISH) to enable the detection of targeted nucleic acid sequences in thousands of individual cells. As a result, flow-FISH offers a distinct advantage over lysate/ensemble-based nucleic acid detection methods because each cell is treated as an independent observation, thereby permitting stronger statistical and variance analyses. These attributes have prompted the use of FISH and flow-FISH methods in a number of different applications and the utility of these methods has been successfully demonstrated in telomere length determination1,2, cellular identification and gene expression3,4, monitoring viral multiplication in infected cells5, and bacterial community analysis and enumeration6.
Traditionally, the specificity of FISH and flow-FISH methods has been imparted by DNA oligonucleotide probes. Recently however, the replacement of DNA oligonucleotide probes with nucleic acid analogs as FISH and flow-FISH probes has increased both the sensitivity and specificity of each technique due to the higher melting temperatures (Tm) of these analogs for natural nucleic acids7,8. Locked nucleic acid (LNA) probes are a type of nucleic acid analog that contain LNA nucleotides spiked throughout a DNA or RNA sequence9,10. When coupled with flow-FISH, LNA probes have previously been shown to outperform conventional DNA probes7,11 and have been successfully used to detect eukaryotic mRNA12 and viral RNA in mammalian cells5.
Here we expand this capability and describe a LNA flow-FISH method which permits the specific detection of RNA in bacterial cells (Figure 1). Specifically, we are interested in the detection of small non-coding regulatory RNA (sRNA) which have garnered considerable interest in the past few years as they have been found to serve as key regulatory elements in many critical cellular processes13. However, there are limited tools to study sRNAs and the challenges of detecting sRNA in bacterial cells is due in part to the relatively small size (typically 50-300 nucleotides in length) and low abundance of sRNA molecules as well as the general difficulty in working with smaller biological cells with varying cellular membranes. In this method, we describe fixation and permeabilzation conditions that preserve the structure of bacterial cells and permit the penetration of LNA probes as well as signal amplification steps which enable the specific detection of low abundance sRNA (Figure 2).

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

A novel high-throughput method is described that enables the detection and relative quantitation of small RNA and mRNA expression from single bacterial cells using locked nucleic acid probes and flow cytometry-fluorescence in situ hybridization.

Verrouillé flux Nucleic Acid cytométrie de fluorescence In situ</emHybridation> (LNA flux FISH): une méthode d&#39;bactérienne détection de l&#39;ARN petits

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Recherche

Immunologie et infection

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

Hybridation<em&gt; In situ</em&gt; Des glandes salivaires, des ovaires et des embryons de moustiques vecteurs

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Fluorescent<em&gt; In situ</emHybridation&gt; sur les chromosomes mitotiques de moustiques

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells and can be further modified to visualize other components in the cell such as infection with viruses and bacteria. Spatial localization and visualization of viruses and bacteria during the infection process is an essential step that complements expression profiling experiments such as microarrays and RNAseq in response to different stimuli. Understanding the spatiotemporal infections with these agents complements biological experiments aimed at understanding their interaction with cellular components. Several techniques for visualizing viruses and bacteria such as reporter gene systems or immunohistochemical methods are time-consuming, and some are limited to work with model organisms&#160;and involve complex methodologies. FISH that targets RNA or DNA species in the cell is a relatively easy and fast method for studying spatiotemporal localization of genes and for diagnostic purposes. This method can be robust and relatively easy to implement when the protocols employ short hybridizing, commercially-purchased probes, which are not expensive. This is particularly robust when sample preparation, fixation, hybridization, and microscopic visualization do not involve complex steps. Here we describe a protocol for localization of bacteria and viruses in insect and plant tissues. The method is based on simple preparation, fixation, and hybridization of insect whole mounts and dissected organs or hand-made plant sections, with 20 base pairs short DNA probes conjugated to fluorescent dyes on their 5&#39; or 3&#39; ends. This protocol has been successfully applied to a number of insect and plant tissues, and can be used to analyze expression of mRNAs or other RNA or DNA species in the cell.

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

We describe here a simple fluorescence in situ hybridization (FISH) method for the localization of viruses and bacteria in insect and plant tissues. This protocol can be extended for the visualization of mRNA in whole mount and microscopic sections.

Fluorescence<em&gt; In situ</em&gt; Hybridations (FISH) pour la localisation des virus et des bactéries dans Endosymbiotic plantes et d&#39;insectes tissus

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Swab Méthode d&#39;échantillonnage pour la détection des norovirus humains sur les surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Basées sur la fluorescence neuraminidase Essai d&#39;inhibition pour évaluer la sensibilité des virus de la grippe à la neuraminidase Inhibiteur Classe de Antiviraux

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

Échantillonnage non invasive de muqueuse liquide pour la Quantification des niveaux d’immunitaire-médiateur In Vivo des voies respiratoires supérieures

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolement de Salmonella typhimurium-contenant des Phagosomes des Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Une plate-forme haut débit pour la détection de Salmonella spp /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout the cell at specific times can be captured with fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence (IF). During lytic herpesvirus infection, the virus hijacks the host cell to preferentially express viral genes, causing changes in cell morphology and behavior of biomolecules. Lytic activities are centered in nuclear factories, termed viral replication compartments, which are discernable only with FISH and IF. Here we describe an adaptable protocol of RNA FISH and IF techniques for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)-infected cells, both adherent and in suspension. The method includes steps for the development of specific anti-sense oligonucleotides, double RNA FISH, RNA FISH with IF, and quantitative calculations of fluorescence intensities. This protocol has been successfully applied to multiple cell types, uninfected cells, latent cells, lytic cells, time-courses, and cells treated with inhibitors to analyze the spatiotemporal activities of specific RNAs and proteins from both the human host and KSHV.

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

We describe a protocol utilizing fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize multiple herpesviral RNAs within lytically infected human cells, either in suspension or adherent. This protocol includes quantification of fluorescence producing a nucleocytoplasmic ratio and can be extended for simultaneous visualization of host and viral proteins with immunofluorescence (IF).

Fluorescence quantitative In Situ Hybridization (FISH) et Immunofluorescence (IF) de produits génétiques spécifiques dans les cellules infectées par le KSHV

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Combinaison de adhésif à base de bandes d'échantillonnage et de fluorescence In situ pour la détection rapide des Salmonella Sur les produits frais