מימון עבור עבודה זו סופק על ידי פרס לגדול ערכים קרן איווה כדי BFBS.

1. משטח דגימה עם דבק סטרילי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר קלטת לשימוש הדגימה. זמינים מסחרית פטריות קלטת או Con-תאקט, זה קלטות הדגימה סטרילי ארוז במיוחד וקלות השימוש. עם זאת, מצאנו כי הקלטת שקוף (ברור אופטית) משרד גנריות יכול לשמש גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בטוש בלתי מחיק לצייר ריבועים 1 2 ס&quot;מ בצד הלא דביק של חתיכה 10 ס&quot;מ של נייר דבק (תבנית הנייר יכול לשמש). זה ישמש כמדריך חזותי לציין באיזה חלק של הסרט נעשה שימוש במדגם השטח מזון או סביבתיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טופס &quot;C&quot; בצורת לולאה של סרט, עם הצד הדביק מול פני השטח להיות שנדגמו. כדי לעשות זאת, החזק את קצוות דביקים עם האגודל והאצבע האמצעית עמדת האצבע על הכיכר נמשך על הגב (לא דביק בצד) של הקלטת (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הניחו את הקלטת על פני השטח להיות שנדגמו ולחץ בעדינות את האזור המסומן נגד פני השטח. מבלי לשחרר את הקצוות של הסרט, השתמש האצבע כדי להבטיח את הצד הדביק של הקלטת בא במגע מלא עם משטח המדגם, הימנעות בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתנועה אפילו לאט למשוך את הקלטת מן המדגם, פיזית חילוץ משטח הנכנס חיידקים. הדקו את הקלטת תא מטען, הצד הדביק למעלה, גבי זכוכית מיקרוסקופ באמצעות משרד הגנרית סרט שקוף. ודאו כי המתח הנכון / מתיחה של הקלטת כך שטוח, ללא המקומט משטח נוצר. זה יעזור לצמצם בעיות עם דפורמציה / סלסול של הקלטת במהלך החימום הבאים במהלך ההכלאה. </li></ol> 2. מוצק שלב העשרה Miniculture פני הנוזל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב מוצק העשרה מבוצע על ידי הצבת את הקלטת עם הפנים כלפי מטה על קסילוז-ליזין Tergitol-4 (XLT-4) צלחות אגר כך התאים שנדגמו ממוקמים במגע ישיר עם השטח אגר. החלק בתבניות קשר / מדגם של הקלטת ממוקם מיושר עם משטח אגר ועל קצה אחד של הקלטת הוא דבק רופף הקיר הצדדי של צלחת פטרי כדי להקל על הסרת קל של הקלטת מפני השטח אגר הבאים העשרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות הם הפוכים (כדי למנוע התעבות) ו מודגרות ב 35-37 ° C כדי לאפשר צמיחה מספקת של סלמונלה spp. משך תקופת הדגירה צורך להעשיר את התאים לרמה לגילוי יהיה תלוי ברמות זיהום ראשוני סלמונלה. ראינו היווצרות microcolony מעולה inocula הראשונית נמוכה לאחר 8 שעות העשרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת העשרה הרצוי, לפתוח את צלחת אגר. הקלטת ישמרו לדביקות שלה במהלך הדגירה. לחץ בעדינות את הקלטת נגד אגר באמצעות האצבע כדי להבטיח התאוששות מרבית של microcolonies נוצר על הממשק קלטת אגר. אחוז קלטת מהקצה מחובר לקיר של צלחת פטרי ולהסיר אותו עם בהילוך איטי אפילו,. הר את הקלטת תא מטען, הצד הדביק למעלה, לשקופית מיקרוסקופ, כמתואר בסעיף 1.5 לעיל. המשיכו לשלב &quot;קיבוע והתייבשות&quot; להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור miniculture פני הנוזל, מתחילים מהדק את הקלטת המשמש הדגימה לשקופית מיקרוסקופ, כמתואר בסעיף 1.5 לעיל. לאחר מכן, לכסות את החלק בתבניות קשר / מדגם של הקלטת עם תא שאינו סטרילי סיליקון זלוף (Coverwell, גרייס Bio-Labs, Inc), ויצרו תא אטום אשר התחתונה מורכבת קלטת התא טעון, הפונה כלפי מעלה. היטב, אבל בעדינות העיתונות חדר למקום על מנת להבטיח חותם למים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בג&#39;ל גמיש טעינת פיפטה קצה, העברת ≤ 500 מרק μL סויה Trypticase או העשרה אחרות בינוני מתאים דרך אחת היציאות קטן של תא מפרצון. חותם בשתי יציאות עם הקלטת למשרד שקוף כדי למנוע אידוי שקופיות דגירה 35 ב -37 ° C לפי הצורך להעשרה מספקת. למרות כל פעולות יש לבצע על פי שיטות דגימה טוב וטיפול, עקרות של סרט נמל איטום או לתאי זלוף אינה נדרשת במהלך miniculture פני הנוזל. השילוב של דגים cytometry זרימה יאפשר אפליה ברורה של Salmonella spp. מתוך אי - יעד חיידקים שעלולים להיות נוכח, עם התרומה הגדולה ביותר של יעד שאינו צומח צפוי לבוא מן המדגם עצמו. המשיכו לשלב &quot;קיבוע והתייבשות&quot; להלן. </li></ol> 3. קיבוע והתייבשות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור דגימה משטח ישיר או להעשרת שלב מוצק של סלמונלה spp. על אגר XLT-4, לבצע על קלטת קיבוע התא למשך 30 דקות ב 25 ° C שנאגרו על ידי כיסוי שטח מגע עם מדגם 500 μL 10% נייטרלי פורמלין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל מקבע לתוך מיכל סגר (מתחת למכסה המנוע כימי כדי למזער את החשיפה מעצבן / אדים רעילים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים בסדרה אתנול (50%, 80% ו 95%; 300 μL / 3 דקות כל ריכוז). המשיכו לשלב &quot;הכלאה&quot; להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור קיבעון של 500 μL מדגם פני הנוזל minicultureים, חדרי זלוף אינן חתומות, ועל קצה גמיש ג&#39;ל טעינת פיפטה משמשת כדי לחלץ את enrichate. Pipetting מהירה למעלה ולמטה משמש כדי להבטיח סילוק יעיל של כל קלטת מחויב התאים הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, כל נפח 500 miniculture μL מועברת צינורית microcentrifuge וסובב אל XG 2000 (5 דקות). Supernatant נמחקת, גלולה היא vortexed 30-60 במרץ עבור s, אז resuspended בנפח שווה של 10% נייטרלי שנאגרו פורמלין. תאים הם קבועים למשך 30 דקות במהירות של 25 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקבע לאחר מכן, הוא הסיר את המדגם הוא resuspended במאגר תא אחסון, כדלקמן. המדגם הוא הסתובב לעבר XG 2000 (5 דקות, 25 ° C) supernatant נמחקת, גלולה היא vortexed במרץ עבור 30-60 s, resuspended בנפח שווה של 50% לא מפוגל אתנול-50% פוספט שנאגרו מלוחים. תאים קבוע ניתן לאחסן לזמן בלתי מוגבל (שנים) ב -20 ° C. הערה: בכל פעם נוזלים משתנים (לדוגמה, כאשר החדרת חיץ מקבע או אחרת), חשוב ביסודיות resuspend (עם vortexing) התא גלולה בחלק מזערי (~ 10-20 μL) של מערכת &quot;היוצא&quot; נוזלי . זה יעזור למנוע clumping ולהבטיח כי השעיות אפילו של תאים בודדים מתקבלים. המשיכו לשלב &quot;הכלאה&quot; להלן. </li></ol> 4. הכלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הכלאה / כביסה חיץ שימוש מסחרי ביולוגיה מולקולרית כיתה פתרונות ציין בטבלה חומרים. סופי מרכיב ריכוזי חיץ הם 0.7 M NaCl, 0.1 מ &#39;טריס [pH 8.0], 10 mM EDTA, נתרן גופרתי 0.1% dodecyl, עשה עד נפח הרצוי הסופי עם מים מולקולרית כיתה ו מסונן באמצעות מזרק 0.22 מיקרומטר או לסנן כוס. המאגר זהה, ללא תוספת של בדיקות (ראה להלן) משמש חיץ כביסה. מחממים הכלאה ושטיפת מאגרים על 55 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף fluorescently שכותרתו Sal3 (Nordentoft et al, 1997;. 5&#39;-AAT CAC TTC ACC TAC GTG-3 &quot;) ו Salm-63 (Kutter et al, 2006;. 5&#39;-TCG ACT GAC TTC AGC TCC-3&quot; ) בדיקות oligonucleotide (לוח חומרים) למאגר הכלאה שחומם מראש. ריכוז בדיקה כוללת של 5 μL -1 ng משמש (למשל 2.5 ננוגרם μL -1 כל בדיקה; Bisha ו-Brehm Stecher, 2009a). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת דוגמיות העשרה ישיר ל-קלטת מוצק שלב, כיסוי המדגם בתבניות לפנות שטח של הקלטת עם μL 300 של חיץ הכלאה המכיל את קוקטייל בדיקה להכליא תאים קלטת כבול בתא, לח הדגרה אטום מוגדר 55 ° C. אם קשר ישיר חממה כגון מכשיר שקופית חפיר (לוח חומרים) משמש, דוגמאות הכלאה של 15 דקות ו&gt; 20 שקופיות יכול להיות מעובד בו זמנית. אם תנור רוטרי בסגנון הכלאה כגון מכשיר במבינו (לוח חומרים) משמש, מגלשות ממוקמים 50 צנטריפוגות מ&quot;ל צינורות פוליפרופילן עבור הכלאה, שקופית אחת לכל צינור. בגלל העברת החום אינה ישירה, דוגמאות אלה הן הכלאה לתקופות ארוכות (עד 30 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הכלאה, מגלשות מוסרים ואת המכילים בדיקה הכלאה שכבת חיץ נמחקת. שקופיות הן מכן לשטוף קצר בעדינות עם חיץ כביסה שחומם מראש על ידי pipetting נפח קטן של המאגר על שקופית מוטה (3 שטיפות של 300 כל μL), או שטף רשמית (עד 30 דקות) עם כיסוי צדי החיץ כביסה שחומם מראש או טבילה שפופרת 50 מ&quot;ל פוליפרופילן צנטריפוגה המכילה מאגר כביסה שחומם מראש. מניסיוננו, למרות לשטוף רשמי יספק תוצאות משופרות (אובך פחות מ בדיקה מאוגד), פשוט לשטוף היא נאותה לאיתור חד משמעי של Salmonella spp. בשלב הבא, הם שקופיות אוויר יבש לפני שעבר את הצעד &quot;איתור&quot; להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכלאה של דגימות נוזל miniculture משטח מבוצע על ידי ספינינג מטה דגימות (שאך קבוע או נשמר חיץ אחסון ב -20 מעלות צלזיוס) במשך 5 דקות XG ב 2000, ואחריו vortexing הנמרצת של גלולה ו resuspension במאגר הכלאה μL שחומם מראש המכיל 100 קוקטייל בדיקה. דוגמאות הן הכלאה על 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות על גוש חום או דגירה אחרות תחנת מתאים (לוח חומרים), ואחריו תוספת של חיץ כביסה μL 500 שחומם מראש. כמו קלטת מחויב דוגמאות, דוגמאות אלה עשויים להיות שטף רשמית עד 30 דקות עם הדגירה נוסף על 55 מעלות צלזיוס במאגר זה לשטוף, עם vortexing לסירוגין. לחלופין, ניתן דגימות vortexed ביסודיות לאחר תוספת של חיץ כביסה μL 500 שחומם מראש, ואחריו קצירת מיידית לניתוח (להלן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקראת זיהוי של סלמונלה spp. דרך cytometry זרימה, נוזל miniculture דגימות פני השטח הם הסתחררו מטה XG 2000 דקות 5, supernatant נמחקת ואת הדגימות resuspended בטמפרטורת החדר 300 μL (~ 25 ° C) PBS. אם דגימות דורשים הובלה למתקן מרוחק, או אם עיכוב צפוי בין הכלאה וניתוח, דגימות יכול להיות בקירור או שנערך על הקרח לפני anaתמוגה. לחלופין, ניתן להעביר דגימות למאגר תא אחסון (50:50 תערובת של PBS ואתנול מוחלט) שנערך -20 ° C עד שבוע ללא הפסד ניכר בדיקה, שמעניקה פלואורסצנטי (Bisha ו-Brehm Stecher, 2009 ב) . </li></ol> 5. איתור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגילוי על קלטת של סלמונלה spp. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ישיר ל-קלטת או מוצק העשרה דגימות שלב הם overlayed עם ~ 10 בינוני μL H-1200 Vectashield הרכבה המכיל את counterstain גרעיני 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), רכוב עם תלוש כיסוי, מודגרות אז בחושך במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמן טבילה מושם על להחליק את המכסה, דגימות נבדקות באמצעות המטרה הגדלה גבוהה שמן (63x או 100x). המסנן DAPI משמש כדי להביא את המדגם אל המוקד, מיקרוסקופ מופעלת ואז לסנן את המתאים (ירוק או אדום, תלוי צבע המשמש קצה התווית בדיקות) ותאי סלמונלה הם הבקיע חזותית על פי הקרינה שלהם (איורים 2 ו -3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגילוי cytometric של דגימות נוזל miniculture פני השטח, מכשירים שונים עשויים לשמש, בהתאם לזמינות המקומית. במעבדה שלנו, PBS, הושעה דגימות מועברים 5 מ&quot;ל סיבוב תחתית צינורות דגימה (BD פלקון) ובדק באמצעות cytometer תזרים FACSCanto עם עירור ב 647 ננומטר (לוח חומרים). לקבלת דוגמיות מועשר המכיל מספר רב של חיידקים בסך הכל, את &quot;זרימת שיעור נמוך&quot; הגדרת (10 דקות μL -1) משמש 5,000-50,000 אירועים נאספים. הנתונים נותחו באמצעות תוכנה FlowJo (גרסה 8.8.6, עץ Star, Inc, Ashland, OR) או ניתוח אחר תוכנה מתאימה (איור 4, לוחות A ו-B). </li></ol> 6. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. השימוש דבק עבור מדגם של Salmonella spp. מפני השטח של עגבניות מזוהמים באופן מלאכותי. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. תוצאות אופייניות של הדגימה ישיר ל-קלטת זיהוי דגים של סלמונלה Typhimurium ATCC 14028 מפני השטח של עגבנייה (100 X אובייקטיבי שמן). קוקטייל של שתי בדיקה של טקסס אדום שכותרתו בדיקות (Sal3/Salm-63) שימש לתייג את התאים האלה. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. Microcolonies של סלמונלה Typhimurium ATCC 14,028 נוצר על פני השטח של אגר ליזין Tergitol-4 (XLT-4) קסילוז אחרי 8 שעות על קלטת העשרה ב 37 ° C. inoculum הראשוני היה שנדגמו מפני השטח של עגבניות מזוהמים באופן מלאכותי. מוצק שלב העשרה מגדיל את מספר התאים הזמינים עבור איתור גם משפר הסלולר תוכן rRNA. <img src="/files/ftp_upload/2308/2308fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. השימוש דבק עבור מדגם של ס enterica serovar Typhimurium מפני השטח של עגבניות מזוהמים באופן מלאכותי, ואחריו ניתוח ישיר באמצעות דגים תזרים cytometry (לוח א &#39;) או לאחר 5 שעות ללא סלקטיבית העשרה miniculture נוזלי משטח בתא זלוף מלא 500 μL Trypticase סויה מרק (לוח ב&#39; ).

<ol>
	<li>Almeida, C., Azevedo, N. F., Fernandes, R. M., Keevil, C. W., Vieira, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+method+using+a+peptide+nucleic+acid+probe+for+the+identification+of+Salmonella+spp.+in+a+broad+spectrum+of+samples.">Fluorescence in situ hybridization method using a peptide nucleic acid probe for the identification of Salmonella spp. in a broad spectrum of samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 4476-4485 (2010).</li><li>Barnetson, R. S., Milne, L. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+sampling+for+Candida+with+adhesive+tape.">Skin sampling for Candida with adhesive tape.</a> Br. J. Dermatol. 88, 487-491 (1973).</li><li>Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+adhesive-tape-based+sampling+of+tomato+surfaces+combined+with+rapid+fluorescence+in+situ+hybridization+for+Salmonella+detection.">Simple adhesive-tape-based sampling of tomato surfaces combined with rapid fluorescence in situ hybridization for Salmonella detection.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 1450-1455 .</li><li>Bisha, B., Brehm-Stecher, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-through+imaging+cytometry+for+characterization+of+Salmonella+subpopulations+in+alfalfa+sprouts,+a+microbiologically+complex+food+system.">Flow-through imaging cytometry for characterization of Salmonella subpopulations in alfalfa sprouts, a microbiologically complex food system.</a> Biotechnol. J. 4, 880-887 (2009).</li><li>Edwards, R. W., Hartman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+collecting+fungus+specimens+from+infected+surfaces.">A simple technique for collecting fungus specimens from infected surfaces.</a> Lloydia. 15, 39-39 (1952).</li><li>Evancho, G. M., Sveum, W. H., Moberg, L. J., Frank, J. F., Pouch Downes, F., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiological+monitoring+of+the+food+processing+environment.">Microbiological monitoring of the food processing environment.</a> Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. , (2001).</li><li>Fung, D. Y. C., Lee, C. Y., Kastner, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+tape+method+for+estimating+microbial+load+on+meat+surfaces.">Adhesive tape method for estimating microbial load on meat surfaces.</a> J. Food. Prot. 43, 295-297 (1980).</li><li>Kutter, S., Hartmann, A., Schmid, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonization+of+barley+(Hordeum+vulgare)+with+Salmonella+enterica+and+Listeria+spp.">Colonization of barley (Hordeum vulgare) with Salmonella enterica and Listeria spp.</a> FEMS Microbiol. Ecol. 56, 262-271 (2006).</li><li>La Cono, V., Urz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+applied+on+samples+taken+with+adhesive+tape+strips.">Fluorescent in situ hybridization applied on samples taken with adhesive tape strips.</a> J. Microbiol. Meth. 55, 65-71 (2003).</li><li>Lakshmanan, C., Schaffner, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+and+controlling+microbiological+contamination+of+beverage+dispensers+in+university+foodservice+operations.">Understanding and controlling microbiological contamination of beverage dispensers in university foodservice operations.</a> Food Prot. Trends. 26, 27-31 (2005).</li><li>Langvad, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+qualitative+and+quantitative+study+of+the+fungal+flora+of+leaves.">A simple and rapid method for qualitative and quantitative study of the fungal flora of leaves.</a> Can. J. Microbiol. 26, 666-670 (1980).</li><li>Nordentoft, S., Christensen, H., Wegener, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+fluorescence-labelled+oligonucleotide+probe+targeting+23S+rRNA+for+in+situ+detection+of+Salmonella+serovars+in+paraffin-embedded+tissue+sections+and+their+rapid+identification+in+bacterial+smears.">Evaluation of a fluorescence-labelled oligonucleotide probe targeting 23S rRNA for in situ detection of Salmonella serovars in paraffin-embedded tissue sections and their rapid identification in bacterial smears.</a> J. Clin. Microbiol. 35, 2642-2648 (1997).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

שיטות פשוטה ומהירה לגילוי של פתוגנים על משטחים לייצר עשוי לסייע להפחית מחלות foodborne על ידי מתן מידע עדכני ושימושי. דבק סרט המבוסס על שיטות הדגימה שימשו מיקרוביולוגיה סביבתית, קלינית מזון מאז 1950 וה לערב הקשה של &quot;סקוטש&quot; בסגנון סרט על משטחים לסילוק של מיקרואורגניזמי...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fungi-Tape sampling tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific Device Laboratory, Des Plaines, IL</td>
<td>745</td>
<td>http://www.scientificdevice.com/</td>
</tr>
<tr>
<td>Con-Tact-It sampling tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Birko Corporation, Denver, CO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>http://www.birkocorp.com/</td>
</tr>
<tr>
<td>Clear office tape, generic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence</td>
</tr>
<tr>
<td>Food surface</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Local grocery</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tomatoes (red tomatoes on the vine, not waxed or oiled) used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypticase Soy Broth</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco, Sparks, MD</td>
<td>211768</td>
<td>For non-selective liquid surface miniculture enrichment</td>
</tr>
<tr>
<td>Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco, Sparks, MD</td>
<td>223420</td>
<td>For Salmonella-selective agar (XLT-4)</td>
</tr>
<tr>
<td>Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco, Sparks, MD</td>
<td>235310</td>
<td>For Salmonella-selective agar (XLT-4)</td>
</tr>
<tr>
<td>Formalin solution </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>HT5011</td>
<td>10% solution, neutral, buffered (cell fixative)</td>
</tr>
<tr>
<td>Absolute ethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>E7023</td>
<td>Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration)</td>
</tr>
<tr>
<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>RNase- and DNase-free</td>
</tr>
<tr>
<td>Microscope slides and cover slips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>S5150</td>
<td>Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component)</td>
</tr>
<tr>
<td>Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>T9285</td>
<td>1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component)</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium dodecyl sulfate solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
<td>L4522</td>
<td>10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component)</td>
</tr>
<tr>
<td>Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Integrated DNA Technologies, Coralville, IA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5&#x2019;-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified</td>
</tr>
<tr>
<td>Variable speed microcentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>CoverWell perfusion chamber </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Grace Bio-Labs Inc., Bend, OR</td>
<td>PC1R-2.0</td>
<td>Non-sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>Gel loading pipette tips (FS MultiFlex)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
<td>05-408-151</td>
<td>Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber</td>
</tr>
<tr>
<td>Aluminum heat block or precision-controlled heating station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Bambino mini hybridization oven</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Boekel Scientific, Feasterville, PA</td>
<td>Model 230300</td>
<td>Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct</td>
</tr>
<tr>
<td>Slide Moat slide hybridizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Boekel Scientific, Feasterville, PA</td>
<td>Model 240000</td>
<td>Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide</td>
</tr>
<tr>
<td>Vectashield H-1200 mounting medium with 4&#x2019;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA</td>
<td>H-1200</td>
<td>Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain</td>
</tr>
<tr>
<td>Fluorescence microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leitz Laborlux S used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Digital camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Canon PowerShot A640 camera used here</td>
</tr>
<tr>
<td>Image acquisition software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used</td>
</tr>
<tr>
<td>Adobe Photoshop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Adobe Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels)</td>
</tr>
<tr>
<td>Flow cytometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used</td>
</tr>
<tr>
<td>Flow cytometry analysis software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Various suppliers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

combination of adhesive-tape-based sampling and fluorescence in situ hybridization for rapid detection of salmonella on fresh produce

פרוטוקול זה מתאר גישה פשוטה עבור דגימה דבק, סרט המבוסס על עגבניות ושאר משטחים תוצרת טרייה, ואחריו הקרינה על הקלטת הכלאה באתרו (FISH) לאיתור תרבות עצמאית מהירה של Salmonella spp. קלטות תא טעון גם יכול להיות ממוקם עם הפנים כלפי מטה על אגר סלקטיבי להעשרת מוצק שלב לפני זיהוי. לחלופין, בנפח נמוך enrichments נוזלי (miniculture פני הנוזל) יכול להתבצע על פני השטח של הקלטת במרק הלא סלקטיבי, ואחריו דגים ניתוח באמצעות cytometry הזרימה. כדי להתחיל, דבק סטרילי מובא במגע עם תוצרת טרייה, לחץ עדין מוחל, ועל הסרט מוסר, פיזית לחילוץ חיידקים המצויים על גבי משטחים אלה. קלטות מורכבים דביקות בצד לעלות על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית התאים שנדגמו הם קבועים עם 10% פורמלין (30 דקות) ו מיובש באמצעות סדרה אתנול מדורגים (50, 80, ו - 95%; 3 דקות כל ריכוז). לאחר מכן, התא טעון קלטות הם הבחינו עם חוצץ המכיל סלמונלה במיקוד DNA קוקטייל בדיקה הכלאה במשך 15 - 30 דקות ב 55 מעלות צלזיוס, ואחריו קצר לשטוף במאגר כביסה להסיר בדיקה מאוגד. חסיד, דגים שכותרתו תאים counterstained מכן עם ה-DNA לצבוע 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) והתוצאות שנצפו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. להעשרת מוצק שלב, תא מטען קלטות ממוקמים עם הפנים כלפי מטה על משטח מתאים אגר סלקטיבי וטופחו על מנת לאפשר צמיחה באתרו של microcolonies סלמונלה, ואחריו דגים מיקרוסקופיה כמתואר לעיל. עבור miniculture פני הנוזל, תא מטען קלטות ממוקמים בצד הדביק למעלה וחדר זלוף סיליקון מוחל כך את הקלטת שקופיות מיקרוסקופ טופס התחתון של תא מים חזק שלתוכו נפח קטן (≤ 500 μL) של Trypticase סויה מרק (TSB) הוא הציג. יציאות כניסת חתומות ותאי מודגרת ב 35-37 מעלות צלזיוס, מה שמאפשר צמיחה המבוססת על הגברה של קלטת חילוץ חיידקים. לאחר דגירה, יציאות כניסת אינן חתומות, תאים מנותקים מעורב עם הגב נמרץ ושוב pipetting, שנקטפו באמצעות צנטריפוגה ותוקנו ב -10% ניטרלית שנאגרו פורמלין. לבסוף, דוגמאות הכלאה ובדק באמצעות זרימת cytometry לגלות נוכחות של סלמונלה spp. כפי שתואר כאן, שלנו &quot;קלטת FISH&quot; הגישה יכולים לספק דגימה פשוטה ומהירה וזיהוי של סלמונלה על משטחים עגבניות. יש לנו גם השתמשו בגישה זו הדגימה סוגים אחרים של תוצרת טרייה, כולל תרד ופלפלים חריפים.

Watch this Scientific Journal Video about Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce at JoVE.com

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

פרוטוקול זה מתאר גישה פשוטה דבק, סרט המבוסס על מדגם של עגבניות ושאר משטחים תוצרת טרייה, ואחריו איתור מהיר של כל תא<em&gt; סלמונלה</em&gt; באמצעות פלואורסצנציה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (FISH).

שילוב של הדגימה דבק קלטת מבוססי פלואורסצנטי באתרו הכלאה עבור איתור מהיר של סלמונלה על תוצרת טרייה

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

combination-adhesive-tape-based-sampling-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

12.9K Views.  Colorado State University. פרוטוקול זה מתאר גישה פשוטה דבק, סרט המבוסס על מדגם של עגבניות ושאר משטחים תוצרת טרייה, ואחריו איתור מהיר של כל תא סלמונלה באמצעות פלואורסצנציה באתרו הכלאה (FISH).

Video: Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular environment. In order to increase throughput, FISH can be combined with flow cytometry (flow-FISH) to enable the detection of targeted nucleic acid sequences in thousands of individual cells. As a result, flow-FISH offers a distinct advantage over lysate/ensemble-based nucleic acid detection methods because each cell is treated as an independent observation, thereby permitting stronger statistical and variance analyses. These attributes have prompted the use of FISH and flow-FISH methods in a number of different applications and the utility of these methods has been successfully demonstrated in telomere length determination1,2, cellular identification and gene expression3,4, monitoring viral multiplication in infected cells5, and bacterial community analysis and enumeration6.
Traditionally, the specificity of FISH and flow-FISH methods has been imparted by DNA oligonucleotide probes. Recently however, the replacement of DNA oligonucleotide probes with nucleic acid analogs as FISH and flow-FISH probes has increased both the sensitivity and specificity of each technique due to the higher melting temperatures (Tm) of these analogs for natural nucleic acids7,8. Locked nucleic acid (LNA) probes are a type of nucleic acid analog that contain LNA nucleotides spiked throughout a DNA or RNA sequence9,10. When coupled with flow-FISH, LNA probes have previously been shown to outperform conventional DNA probes7,11 and have been successfully used to detect eukaryotic mRNA12 and viral RNA in mammalian cells5.
Here we expand this capability and describe a LNA flow-FISH method which permits the specific detection of RNA in bacterial cells (Figure 1). Specifically, we are interested in the detection of small non-coding regulatory RNA (sRNA) which have garnered considerable interest in the past few years as they have been found to serve as key regulatory elements in many critical cellular processes13. However, there are limited tools to study sRNAs and the challenges of detecting sRNA in bacterial cells is due in part to the relatively small size (typically 50-300 nucleotides in length) and low abundance of sRNA molecules as well as the general difficulty in working with smaller biological cells with varying cellular membranes. In this method, we describe fixation and permeabilzation conditions that preserve the structure of bacterial cells and permit the penetration of LNA probes as well as signal amplification steps which enable the specific detection of low abundance sRNA (Figure 2).

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

A novel high-throughput method is described that enables the detection and relative quantitation of small RNA and mRNA expression from single bacterial cells using locked nucleic acid probes and flow cytometry-fluorescence in situ hybridization.

נעול חומצות גרעין תזרים cytometry פלואורסצנציה באתרו</emהכלאה> (LNA זרימה FISH): שיטה לגילוי חיידקי RNA קטנים

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

הכלאה<em&gt; באתרו</em&gt; של בלוטות הרוק, השחלות, ועוברים של וקטור יתושים

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

פלואורני<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה על כרומוזומים mitotic של יתושים

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells and can be further modified to visualize other components in the cell such as infection with viruses and bacteria. Spatial localization and visualization of viruses and bacteria during the infection process is an essential step that complements expression profiling experiments such as microarrays and RNAseq in response to different stimuli. Understanding the spatiotemporal infections with these agents complements biological experiments aimed at understanding their interaction with cellular components. Several techniques for visualizing viruses and bacteria such as reporter gene systems or immunohistochemical methods are time-consuming, and some are limited to work with model organisms&#160;and involve complex methodologies. FISH that targets RNA or DNA species in the cell is a relatively easy and fast method for studying spatiotemporal localization of genes and for diagnostic purposes. This method can be robust and relatively easy to implement when the protocols employ short hybridizing, commercially-purchased probes, which are not expensive. This is particularly robust when sample preparation, fixation, hybridization, and microscopic visualization do not involve complex steps. Here we describe a protocol for localization of bacteria and viruses in insect and plant tissues. The method is based on simple preparation, fixation, and hybridization of insect whole mounts and dissected organs or hand-made plant sections, with 20 base pairs short DNA probes conjugated to fluorescent dyes on their 5&#39; or 3&#39; ends. This protocol has been successfully applied to a number of insect and plant tissues, and can be used to analyze expression of mRNAs or other RNA or DNA species in the cell.

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

We describe here a simple fluorescence in situ hybridization (FISH) method for the localization of viruses and bacteria in insect and plant tissues. This protocol can be extended for the visualization of mRNA in whole mount and microscopic sections.

פלואורסצנציה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאות (דגים) ללוקליזציה של וירוסים וחיידקים Endosymbiotic בצמח ורקמות חרקים

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

שיטת הדגימה ספוגית לצורך זיהוי של norovirus האדם על משטחים

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

קרינה המבוססת Assay Neuraminidase העיכוב להעריך את הרגישות של שפעת וירוסים אל Neuraminidase המונע המחלקה של תרופות אנטי-ויראליות

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

לא פולשנית דגימה של נוזל שורות Mucosal עבור כימות של In Vivo דרכי הנשימה העליונות החיסון-מגשרת רמות

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout the cell at specific times can be captured with fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence (IF). During lytic herpesvirus infection, the virus hijacks the host cell to preferentially express viral genes, causing changes in cell morphology and behavior of biomolecules. Lytic activities are centered in nuclear factories, termed viral replication compartments, which are discernable only with FISH and IF. Here we describe an adaptable protocol of RNA FISH and IF techniques for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)-infected cells, both adherent and in suspension. The method includes steps for the development of specific anti-sense oligonucleotides, double RNA FISH, RNA FISH with IF, and quantitative calculations of fluorescence intensities. This protocol has been successfully applied to multiple cell types, uninfected cells, latent cells, lytic cells, time-courses, and cells treated with inhibitors to analyze the spatiotemporal activities of specific RNAs and proteins from both the human host and KSHV.

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

We describe a protocol utilizing fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize multiple herpesviral RNAs within lytically infected human cells, either in suspension or adherent. This protocol includes quantification of fluorescence producing a nucleocytoplasmic ratio and can be extended for simultaneous visualization of host and viral proteins with immunofluorescence (IF).

פלואורסצנטית כמותי באתרו היברידיזציה (דג) ו Immunofluorescence (IF) של מוצרים גנטיים ספציפיים בתאים שנדבקו KSHV

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...