Nous sommes redevables à Stephan Schwartz et Christian Gutzen des Biobserve GmbH pour le parrainage de cet article et de l&#39;assistance technique beaucoup. Nous remercions Olivia Ochoa, Christian Kaufmann, et Zachary Cress de l&#39;aide pour les soins de poissons; nous sommes reconnaissants envers le gouvernement fédéral mexicain pour la permission de recueillir les poissons. Nous sommes redevables à Glen Vigus, Frédéric Parke, et le Laboratoire de visualisation à la Texas A &amp; M. Athéna Mason et Ryan Easterling aidé à préparer cette publication. Le financement a été fourni par Texas A &amp; M University et NSF IOS-1045226.

1. Mise en place du matériel et du système Viewer. Le système se compose d&#39;un réservoir de tests encadrée par deux moniteurs. Une caméra vidéo connectée au système Viewer BIOBSERVE enregistre le mouvement du sujet en temps réel. Données de mouvement est transmis à la lecture de la vidéo interactive (IVP) programme sur un serveur distinct, qui détermine le mouvement du stimulus animés sur l&#39;écran. <ol><li> Placez deux moniteurs CRT aux extrémités opposées d&#39;un aquarium de 80 l rempli d&#39;eau propre; sortie moniteur match. </li><li> Placez l&#39;appareil photo aérienne pour capturer la vue de l&#39;aquarium; connecter à BIOBSERVE carte vidéo. </li><li> Configurer le système de visionneuse de recevoir des informations de suivi de la caméra. </li><li> Activer le plug-in l&#39;Observateur qui envoie les coordonnées du museau de l&#39;animal, le corps et la queue vers le serveur d&#39;animation en temps réel via une adresse IP du réseau spécifié. </li><li> Allumez le serveur de l&#39;animation. </li></ol> 2. Etalonnage. <ol><li> Sur le serveur animation, ouvrez InteractiveDisplaySetup.txt. Entrer la largeur et la hauteur d&#39;écran écran en pixels sous la rubrique «Infos Moniteur&quot;. Sous la rubrique «ProgramType&quot; entrer &quot;calibrage&quot;. Enregistrer les modifications au fichier. </li><li> Double-cliquez sur l&#39;icône du programme IVP pour démarrer le programme. </li><li> Entrez dans l&#39;étendue de la dimension du réservoir de mettre en place dans le système de visionneuse à l&#39;étape 2.3. Cela permettra d&#39;assurer la correspondance entre les données de sortie Viewer et interactive à partir IVP. </li><li> Comme les extrémités des réservoirs de poissons sont plus petits que les moniteurs, le logiciel permet à l&#39;utilisateur d&#39;utiliser le clavier (A et S pour la largeur, Z et X pour la hauteur, et les touches directionnelles pour la position) pour déplacer la zone de visualisation (viewport) du stimuli pour s&#39;aligner avec les extrémités de la cuve d&#39;essai. Consultés sur le serveur de l&#39;animation, la fenêtre rose est fait l&#39;écho sur un moniteur d&#39;essai et la fenêtre bleue sur l&#39;autre (figure 1). </li><li> Utilisez z et x sur le clavier à l&#39;échelle de l&#39;affichage des poissons mâles sur les deux fenêtres jusqu&#39;à ce qu&#39;elle corresponde à la taille désirée de relance. </li><li> Déplacez les boîtes affiché afin de les aligner sur les bords de la cuve d&#39;essai. L&#39;utilisateur utilise les touches Q ou W pour déplacer les boîtes rapproche ou s&#39;éloigne du centre du poisson. </li><li> Entrez les informations expérience lorsque vous êtes invité par le programme. L&#39;utilisateur a la possibilité de choisir parmi les modèles préchargés (dans notre démonstration, courtiser mâles Xiphophorus birchmanni, X. Malinche). L&#39;utilisateur spécifie également le comportement de chaque poisson dans chaque étape (non-interactif ou interactif), le côté et le stade dans lequel chaque stimulus apparaît, et la taille désirée (longueur standard) de chaque stimulus. </li><li> La question suivante vous demande si l&#39;utilisateur souhaite les mouvements des poissons à mettre en miroir, c&#39;est à dire que le mouvement du modèle de chaque côté de l&#39;aquarium seront exactement les mêmes. Ceci n&#39;est utilisé que lorsque les poissons sont à la fois en mode animation. Les dernières questions concernent le mouvement de la nageoire dorsale. L&#39;utilisateur peut sélectionner par défaut dorsale, ce qui rendrait la dorsale ne soulèvent lors d&#39;une parade nuptiale latérale. Si la dorsale n&#39;est pas réglé par défaut, l&#39;utilisateur peut décider si le modèle soulève sa nageoire dorsale, selon la distance du sujet par le moniteur. </li></ol> 3.Starting IVP pour les maté-test à choix. <ol><li> InteractiveDisplaySetup.txt et réglez &quot;ProgramType&quot; à liveTesting et mettre &#39;experimentName&#39; au nom même fichier qui contient les données d&#39;expérimentation. </li><li> Placez délicatement les poissons dans l&#39;aquarium sous réserve et attendre 10 min. </li><li> Démarrez le 2.0 et le visualiseur IVP. </li></ol> 4. Mate-choix procès. La séquence globale d&#39;expérimentation suit des études antérieures utilisant des stimuli vidéo non-interactif 1-4. Les femelles sont présentés avec deux stimuli différents sur des écrans aux extrémités opposées d&#39;un aquarium de tests. Le comportement des femmes est suivi en temps réel par le système Viewer Biobserve. Le test de réponse est le temps d&#39;association, la quantité de temps qu&#39;une femme consacre moins de 10 cm d&#39;un moniteur ou l&#39;autre. Temps de l&#39;Association est automatiquement calculée par le spectateur. <ol><li> Les stimuli vidéo sont affichés à des sujets dans un essai consistant en deux, de 20 minutes étapes. Une étape se compose de quatre segments de 5 minutes: <ol><li> Le premier segment acclimate la femelle à la cuve de test pendant cinq minutes en affichant un écran monochrome sur les deux moniteurs. </li><li> Dans le deuxième segment, deux stimuli vidéo différents sont affichés à la femelle, l&#39;un sur l&#39;écran de gauche et l&#39;autre sur le droit pendant cinq minutes. </li><li> Immédiatement après l&#39;affichage des stimuli vidéo, un écran monochrome est de nouveau affiché sur les deux moniteurs pendant cinq minutes. </li><li> Dans le quatrième et dernier segment, les stimuli du deuxième segment sont présentées, mais la position de chaque stimulus est allumé. Cela fournit un contrôle au sein-femme pour le biais de côté. </li></ol></li><li> Le secstade de deuxième répète le même schéma, avec un ensemble différent de stimuli simultanément présentés. </li><li> Des essais supplémentaires sont gérés par un retour à l&#39;étape 2 et varier systématiquement côté et ordre de présentation. </li></ol> 5. Des résultats représentatifs. Nous avons évalué l&#39;efficacité de la lecture interactive en comparant la réponse des femmes à des animations interactives et non interactives de mâles courtisent. Le stimulus non-interactif réalisé un stimulus séduction à l&#39;écran, indépendamment du comportement des femmes, comme dans de précédentes études 1-4. Le stimulus interactives suivies de la position horizontale de la femelle à travers l&#39;écran. La position du poisson soit simulée ou le poisson a été soumise opérationnellement défini comme le milieu de la ligne reliant le centre de gravité et le museau. Les trois règles qui guident le comportement des hommes étaient comme suit, où la direction X se réfère à la longueur de la cuve, et la direction Z se réfère à la largeur de la cuve (figure 2): Règle 1: Les hommes de simulation suit toujours le sujet à travers l&#39;écran, son suivi dans la direction Z. Règle 2: la nageoire dorsale du mâle simulé n&#39;est soulevée quand il effectue une parade nuptiale latérale. Règle 3: Le poisson xipho simulées mâle uniquement effectuer une parade nuptiale latérale pour 50% du temps total qu&#39;il est affiché à la femelle. La parade nuptiale latérale est déclenchée par le poisson mâle étant au sein d&#39;un quart la longueur du corps masculin de la femelle dans la direction Z. La parade nuptiale latéraux est indépendante de la proximité de la femelle est à l&#39;écran dans la direction X. Le stimulus interactifs suivi de près la position de la femelle en temps réel (figure 3). Des travaux antérieurs utilisant des stimuli non-interactive a montré que 4,5 X. féminine birchmanni fortement préféré des signaux visuels de leur propre espèce. Les stimuli non-interactif créé par l&#39;IVP ont été tout aussi efficace à connaître les préférences du compagnon conspécifiques (t = 1,923, N = 9, p = 0,046). Lorsque les femelles ont été testés sur des simulations interactives mâles conspécifiques et hétérospécifiques immédiatement avant ou après dans le même procès, cependant, ils ont échoué à montrer une préférence (figure 4). <img src="/files/ftp_upload/2374/2374fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Moniteur d&#39;installation pour l&#39;étalonnage. <img src="/files/ftp_upload/2374/2374fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Vue schématique du réservoir et de configuration du moniteur, indiquant les axes utilisés pour décrire la position. <img src="/files/ftp_upload/2374/2374fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Position horizontale du modèle d&#39;animation et représentant sujet féminin dans le temps. <img src="/files/ftp_upload/2374/2374fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Temps de l&#39;Association (s) de femmes ayant interactifs et non interactifs conspécifiques et hétérospécifiques stimuli masculins. Chaque parcelle est créée à partir d&#39;un record de cinq minutes de la sortie de postes par le prototype. Dans ces parcelles, le temps progresse dans la direction Y verticale de 0 à 5 minutes. <img src="/files/ftp_upload/2374/2374fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Données représentatives du temps d&#39;association et de suivi par deux stimuli interactifs. Deux segments de cinq minutes pour les deux femelles sont affichées.

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	<li>Fisher, H. S., Mascuch, S., Rosenthal, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivariate+male+traits+misalign+with+multivariate+female+preferences+in+the+swordtail+fish,+Xiphophorus+birchmanni.">Multivariate male traits misalign with multivariate female preferences in the swordtail fish, Xiphophorus birchmanni.</a> Anim. Behav. 78, 265-269 (2009).</li><li>Fisher, H. S., Rosenthal, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hungry+females+show+stronger+mating+preferences.">Hungry females show stronger mating preferences.</a> Behavioral Ecology. 17, 979-981 (2006).</li><li>Fisher, H. S., Rosenthal, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+swordtails+court+with+an+audience+in+mind.">Male swordtails court with an audience in mind.</a> Biology Letters. 3, 5-7 (2007).</li><li>Wong, B. B. M., Rosenthal, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+disdain+for+swords+in+a+swordtail+fish.">Female disdain for swords in a swordtail fish.</a> American Naturalist. 167, 136-140 (2006).</li><li>Fisher, H. S., Wong, B. B. M., Rosenthal, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+the+chemical+environment+disrupts+communication+in+a+freshwater+fish.">Alteration of the chemical environment disrupts communication in a freshwater fish.</a> Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 273, 1187-1193 (2006).</li><li>Rosenthal, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+considerations+and+techniques+for+constructing+video+stimuli.">Design considerations and techniques for constructing video stimuli.</a> Acta Ethol. 3, 49-54 (2000).</li><li>Turnell, E. R., Mann, K. D., Rosenthal, G. G., Gerlach, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mate+choice+in+zebrafish+(Danio+rerio)+analyzed+with+video-stimulus+techniques.">Mate choice in zebrafish (Danio rerio) analyzed with video-stimulus techniques.</a> Biol. Bull. 205, 225-226 (2003).</li><li>Rosenthal, G. G., Ryan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assortative+preferences+for+stripes+in+danios.">Assortative preferences for stripes in danios.</a> Animal Behaviour. 70, 1063-1066 (2005).</li><li>Reynolds, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flocks,+herds+and+schools:+A+distributed+behavioral+model.">Flocks, herds and schools: A distributed behavioral model.</a> , 256 (1985).</li><li>Reynolds, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Steering+Behaviors+For+Autonomous+Characters.">Steering Behaviors For Autonomous Characters.</a> , (1999).</li><li>Hoare, D. J., Couzin, I. D., Godin, J. -. G. J., Krause, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Context-dependent+group+size+choice+in+fish.">Context-dependent group size choice in fish.</a> Animal Behaviour. 65, 663-669 (2004).</li><li>Hoare, D. J. &. a. m. p. ;. a. m. p., Krause, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+organisation,+shoal+structure+and+information+transfer.">Social organisation, shoal structure and information transfer.</a> Fish and Fisheries. 4, 269-279 (2003).</li></ol>

La production de cette vidéo article a été parrainé par la recherche Biobserve.

Les méthodes précédentes pour la lecture vidéo interactive dans le comportement des animaux se sont appuyés sur un opérateur humain pour fournir les réponses aux indices comportementaux chez les sujets. Avec IVP, nous avons créé un programme qui applique les règles de l&#39;interactivité basée en réponse à temps réel, des données automatisée sur le comportement des sujets. Nous brièvement les étapes de la création du programme ci-dessous. La première étape était de créer numériques exemplaires mâles de X. birchmanni et X. Malinche. Nous avons pris une approche semblable à celle des études précédentes 6. Nous avons créé des maillages 3D qui sont calquées sur les textures à partir de photographies du réel x. birchmanni et X. Malinche. Pour capturer les textures réalistes du vrai poisson, les mêmes photographies utilisées pour modéliser les formes de poissons ont été utilisées comme textures pour les poissons. Une carte planaire appliquées à leurs coordonnées UV aligné la carte UV avec la texture photo. Deuxièmement, le maillage des poissons numérique doit se déforment comme un vrai poisson. Pour ce faire, un squelette virtuel a été créé pour le corps et les nageoires et les «écorchés» pour la maille. Le processus de dépouillement permet le maillage de se déformer lorsque les articulations sont en rotation. Deuxièmement, nous avons ajouté motion pour le poisson numérique. Six mouvements clés qui un poisson xipho mâle fait ont été animés. Trois de ces mouvements ont été utilisées pour représenter les différentes vitesses au cours de laquelle un poisson nager. Les trois autres mouvements ont été les poissons restants encore, le tournage, ou présentant une parade nuptiale latérale. Comme les hommes peuvent élever ou abaisser leur nageoire dorsale conformément à savoir si les récepteurs masculins ou féminins sont présents 3, nous avons découplé du mouvement de la nageoire dorsale de celui de la parade nuptiale latérale. La nageoire dorsale a été saisi afin qu&#39;il puisse être relevé ou abaissé à tout moment pendant le cycle. Un total de cycles d&#39;animation de vingt à quatre ont été utilisés. Chaque cycle a commencé et s&#39;est terminée avec le poisson dans la même posture afin que les cycles d&#39;animation pourraient facilement se fondre ensemble. Tous les cycles d&#39;animation de vingt à quatre ont été créées par rotoscopie 7,8 le mouvement souhaité de la vidéo-dessus d&#39;un live, courtiser mâles X. birchmanni. Troisièmement, nous avons permis à l&#39;interactivité. Nous avons utilisé le système Viewer Biobserve de suivre en temps réel la position du museau, le corps et la queue du xipho femelle et de transmettre cette information en temps réel pour le programme IVP. Cela a été fait séparément pour chaque mâle courtise sur chaque moniteur. L&#39;animation des hommes suivis de position des poissons sujet. Nous avons modélisé suivant à l&#39;aide de Reynolds est arrivé 9,10 comportement de la direction, qui a permis aux hommes de suivre les femmes et ralentir à l&#39;approche de la femelle. Pour calculer la position du poisson xipho mâle à chaque pas de temps, le système a été fourni avec la position actuelle de la femelle, ce qui a permis au programme de calculer les forces qui animent le mâle. Tout d&#39;abord, le vecteur-cible offset a été calculé en soustrayant la position des poissons mâles de la position de la femelle. Deuxièmement la distance entre le poisson mâle à la femelle a été déterminé en prenant de l&#39;ampleur du vecteur cible de compensation. Troisièmement, la vitesse désirée du poisson mâle a été déterminée en divisant la distance par une valeur de décélération constante. Cela a permis aux poissons mâles à ralentir à l&#39;approche du poisson femelle. Dernière, l&#39;accélération souhaitée a été calculé en soustrayant la vitesse du courant du mâle de la vitesse désirée. Comme les animations sont rendus comme des cadres discrets de la vidéo à 60 Hz, les calculs ont été effectués pour chaque étape de temps discrets, à des intervalles de 0,016 secondes. Vitesse maximale a été fixée à une valeur de 10 cm / s pour ces expériences. Si l&#39;ampleur de la nouvelle vitesse était supérieure à la vitesse maximale, la vitesse a été réglée au maximum. Pour cette simulation particulière, les poissons mâles interactifs soulevé sa nageoire dorsale 50% du temps, et seulement pendant les interactions cour. Le comportement de cour latérale d&#39;affichage a été déclenchée lorsque le stimulus masculin était de moins de 0,25 longueurs corps du poisson xipho femmes dans la dimension Z. Nous avons été surpris que l&#39;interactivité aboli la préférence des femmes pour les congénères, malgré le fait que les animations non-interactif a suscité une forte préférence et étant donné que les femmes ont passé la majorité du temps de s&#39;associer avec les stimuli interactifs. Une possibilité est que suit de près la femelle peut l&#39;emporter sur des indices visuels utilisés pour évaluer les mâles, comme l&#39;épée et la nageoire dorsale. Alternativement, les femelles peuvent être moins susceptibles de perdre de l&#39;intérêt chez un homme de cour, et donc moins susceptibles de l&#39;échantillon à la fois les individus (figure 5). Néanmoins, nos résultats montrent que le principe de fonctionnement de la technologie du jeu vidéo à savoir, piloté par logiciel, fondé sur des règles agents répondant à l&#39;entrée utilisateur peut être appliquée avec succès à la lecture interactive dans des études dele comportement animal. Ce type de règles basé lecture interactive devrait s&#39;avérer utile pour les études de mouvement et collectif shoaling 11,12. En particulier, la capacité de manipuler les règles qu&#39;un exemplaire virtuel utilise des bancs devrait nous donner un aperçu des processus qui utilisent les animaux pour prendre des décisions bancs.

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		<tr>
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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Maya 8.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>C# program using Microsoft&#x2019;s XNA Game Studio 2.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BIOBSERVE Viewer 2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dell 15&#x201D; CRT monitor (2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>20 X 20 X 80 cm Plexiglas testing aquarium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dell Latitude computer (animation server)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

automated interactive video playback for studies of animal communication

Lecture vidéo est une technique largement utilisée pour la manipulation contrôlée et la présentation des signaux visuels dans la communication animale. En particulier, basé sur des paramètres d&#39;animation par ordinateur offre la possibilité de manipuler indépendamment n&#39;importe quel nombre de caractéristiques comportementales, morphologiques ou spectrales dans le contexte des réalistes, des images animées d&#39;animaux à l&#39;écran. Une limitation importante de la lecture classique, cependant, est que le stimulus visuel n&#39;a pas la capacité d&#39;interagir avec l&#39;animal vivant. Empruntant la technologie du jeu vidéo, nous avons créé un système automatisé et interactif pour la lecture vidéo qui contrôle les animations en réponse à des signaux en temps réel à partir d&#39;un système de suivi vidéo. Nous avons démontré cette méthode en menant compagnon de choix des essais sur les poissons porte-épée féminine, Xiphophorus birchmanni. Les femelles ont reçu un choix simultané entre un mâle courtisant conspécifiques et un mâle courtisant hétérospécifiques (X. Malinche) sur les côtés opposés d&#39;un aquarium. Le stimulus virtuel masculine a été programmé pour suivre la position horizontale de la femme, en tant que mâles courtisent faire dans l&#39;état sauvage. Mate-le choix des essais sur les sauvages X. femelles birchmanni ont été utilisés pour valider la capacité du prototype efficacement générer un stimulus réaliste visuelle.

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Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Lecture vidéo est une technique largement utilisée dans le comportement animal. Nous avons créé et évalué un programme qui s&#39;applique à base de règles, la lecture interactive en 3-D des animations par ordinateur en réponse à temps réel, des données automatisée sur le comportement des sujets.

Lecture automatique Interactive Video pour les études de la communication animale

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.2K vues.  Texas A&M University (TAMU). Lecture vidéo est une technique largement utilisée dans le comportement animal. Nous avons créé et évalué un programme qui s'applique à base de règles, la lecture interactive en 3-D des animations par ordinateur en réponse à temps réel, des données automatisée sur le comportement des sujets.

Vidéo: Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

Cultures organotypiques cérébelleuse: Défis apoptotiques et détection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Recherche

Neurosciences

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Photolyse des composés en cage dans les cils olfactifs des neurones sensoriels

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to investigate the effects of locally manipulated neurotransmitter and signaling pathways in awake, behaving animals. Moreover, the stereotaxic implantation of electrodes for electrophysiological stimulation and recording studies has been instrumental to our current understanding of neuroplasticity and brain networks in behaving animals. Ever-increasing knowledge about optimizing surgical techniques in rodents1-4, public awareness concerning animal welfare issues and stringent legislation (e.g., the 2010 European Union Directive on the use of laboratory animals5) prompted us to refine these surgical procedures, particularly with respect to implementing new procedures for oxygen supplementation and the continuous monitoring of blood oxygenation and heart rate levels during the surgery as well as introducing a standardized protocol for post-surgical care. Our observations indicate that these modifications resulted in an increased survival rate and an improvement in the general condition of the animals after surgery (e.g. less weight loss and a more active animal). This video presentation will show the general procedures involved in this type of stereotaxic surgery with special attention to our several modifications. We will illustrate these surgical procedures in rats, but it is also possible to perform this type of surgery in mice or other small laboratory animals by using special adaptors for the stereotaxic apparatus6.

Stereotaxic surgery on rodents allows for targeted administration of drugs or electrical stimulation and recordings in awake, behaving animals. In this video presentation we will demonstrate recent procedural refinements to this long-standing procedure that successfully improved survival rate and reduced post-surgical weight loss.

Chirurgie stéréotaxique rongeurs et des améliorations pour la protection des animaux Résultat Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small pieces of tissue, larger specimens like the intact brain pose a problem for immersion fixation because the fixative does not reach all regions of the tissue at the same rate 5,7. Often, changes in response to hypoxia begin before the tissue can be preserved 12. The advantage of directly perfusing fixative through the circulatory system is that the chemical can quickly reach every corner of the organism using the natural vascular network. In order to utilize the circulatory system most effectively, care must be taken to match physiological pressures 3. It is important to note that physiological pressures are dependent on the species used. Techniques for perfusion fixation vary depending on the tissue to be fixed and how the tissue will be processed following fixation. In this video, we describe a low-cost, rapid, controlled and uniform fixation procedure using 4% paraformaldehyde perfused via the vascular system: through the heart of the rat to obtain the best possible preservation of the brain for immunohistochemistry. The main advantage of this technique (vs. gravity-fed systems) is that the circulatory system is utilized most effectively.

Here we describe a low-cost, rapid, controlled and uniform fixation procedure using 4% paraformaldehyde perfused via the vascular system: through the heart of the rat to obtain the best possible preservation of the brain.

Whole fixation par perfusion des animaux pour rongeurs

The goal of fixation is to rapidly and uniformly preserve tissue in a life-like state. While placing tissue directly in fixative works well for small ...

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. Few studies have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem, which contains second order neurons of the auditory pathway, is a potential site for gene transfer. In this protocol, a technique for direct and maximal exposure of the murine DCN via a posterior fossa approach is demonstrated. This approach allows for either acute or survival surgery. Following direct visualization of the DCN, a host of experiments are possible, including injection of opsins into the cochlear nucleus and subsequent stimulation by an optical fiber coupled to a blue light laser.&#160;Other neurophysiology experiments, such as electrical stimulation and neural injector tracings are also feasible.&#160;The level of visualization and the duration of stimulation achievable make this approach applicable to a wide range of experiments.

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

Visualisation directe de la Dorsale murin Cochlear Nucleus pour optogénétiques stimulation de la voie auditive

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Assessment and Communication for People with Disorders of Consciousness

In this experiment, we demonstrate a suite of hybrid Brain-Computer Interface (BCI)-based paradigms that are designed for two applications: assessing the level of consciousness of people unable to provide motor response and, in a second stage, establishing a communication channel for these people that enables them to answer questions with either &#39;yes&#39; or &#39;no&#39;. The suite of paradigms is designed to test basic responses in the first step and to continue to more comprehensive tasks if the first tests are successful. The latter tasks require more cognitive functions, but they could provide communication, which is not possible with the basic tests. All assessment tests produce accuracy plots that show whether the algorithms were able to detect the patient&#39;s brain&#39;s response to the given tasks. If the accuracy level is beyond the significance level, we assume that the subject understood the task and was able to follow the sequence of commands presented via earphones to the subject. The tasks require users to concentrate on certain stimuli or to imagine moving either the left or right hand. All tasks are designed around the assumption that the user is unable to use the visual modality, and thus, all stimuli presented to the user (including instructions, cues, and feedback) are auditory or tactile.

With this experiment, one might be able to detect consciousness in people with disorders of consciousness. Furthermore, the approach can create a simple communication channel that enables people to give simple YES/NO answers to questions.

Évaluation et communication pour les personnes atteintes de troubles de la conscience

In this experiment, we demonstrate a suite of hybrid Brain-Computer Interface (BCI)-based paradigms that are designed for two applications: assessing the ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

Ablation d’une Population neuronale à l’aide d’un Laser à deux photons et son évaluation à l’aide d’imagerie calcique et enregistrement comportemental chez les larves de poisson zèbre

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the study of &#945;S aggregation in Parkinson&#39;s Disease (PD). Recently, the development of new animal models through the exogenous inoculation of brain extracts from diseased &#945;S transgenic mice or PD patients has given new hopes to the possibility of creating more adequate cell models of &#945;S aggregation. Unfortunately, when it comes to cells in cultures, administration of raw brain extracts has not proven as successful as in mice and the source of choice of exogenous aggregates is still in vitro preformed &#945;S fibrils.
We have developed a method to induce the formation of intracellular &#945;S inclusions in primary neurons through the exogenous administration of native microsomes-associated &#945;S aggregates, a highly toxic &#945;S species isolated from diseased areas of transgenic mice. This fraction of &#945;S aggregates that is associated with the microsomes vesicles, is efficiently internalized and induces the formation of intracellular inclusions positive for aggregated and phosphorylated &#945;S. Compared to in vitro-preformed fibrils which are made from recombinant &#945;S, our method is faster and guarantees that the pathogenic seeding is made with authentic &#945;S aggregates extracted from diseased animal models of PD, mimicking more closely the type of inclusions obtained in vivo. As a result, availability of tissues rich in &#945;S inclusions is mandatory.
We believe that this method will provide a versatile cell-based model to study the microscopic aspects of &#945;S aggregation and the related cellular pathophysiology in vivo and will be a starting point for the creation of more accurate and sophisticated cell paradigm of PD.

The goal of this protocol is to provide a cell-based system that replicates the formation of alpha-synuclein aggregates in vivo. Intracellular alpha-synuclein inclusions are seeded in primary neurons by the internalization and propagation of exogenous administered native microsomes-associated alpha-synuclein aggregates isolated from diseased alpha-synuclein transgenic mice.

Administration exogène d’Alpha-synucléine Microsomes associées aux agrégats de neurones primaires comme un modèle de cellulaire puissant de la Formation de fibrilles

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging de neurones corticaux en souris néonatales

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

Préparation in vitro en tranches compensées pour imiter la connectivité du circuit neuronal In Vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...