Cavefish élève comme une fresque animale fantastique pour comprendre l’évolution et les processus biomédicaux. Nous menons maintenant une enquête biomédicale en utilisant ces caractères comme un parallèle d’un symptôme humain. Ici, nous allons montrer la batterie de l’analyse des comportements et le système d’analyse qui peut être utilisé à la fois pour les études évolutives et biomédicales.
Pour apaiser les vibrations attire et le comportement, une tige de verre vibrante est insérée dans un bol en verre contenant un poisson dans l’obscurité. Les poissons sont acclimatés quatre jours avant l’essai dans de l’eau conditionnée avec un cycle sombre de 12, 12 éclaircies. La veille du jour de l’essai après trois jours d’acclimation, remplacer l’eau dans la chambre d’essai par de l’eau fraîchement conditionnée.
Le jour de l’essai, les poissons sont privés de nourriture jusqu’à ce que l’essai soit terminé, parce que l’arrêt changera leur réponse aux vibrations. Préparer l’appareil émettant des vibrations en accordant à 40 Hertz. Définissez les paramètres d’enregistrement appropriés, les conditions de stock et le fichier de destination.
Placez le cylindre d’essai sur la scène d’enregistrement, éclairé par le rétro-éclairage infrarouge dans une pièce sombre, et laissez les poissons s’acclimater pendant trois minutes après avoir été placés sur la scène. Après l’acclimation de trois minutes dans l’obscurité, enregistrez trois minutes et 30 secondes de vidéo. Au début de l’enregistrement, insérez la tige de verre vibrante de 7,5 millimètres de diamètre dans la colonne d’eau, d’environ 5 centimètres de profondeur.
Évitez de faire du bruit ou des vibrations tout en positionnant la tige de verre vibrante dans l’eau, car les poissons peuvent détecter des bruits et des vibrations mineurs. Assurez-vous de terminer cette procédure dans les 30 secondes qui ont après le début de l’enregistrement vidéo pour vous assurer que plus de trois minutes de comportement sont enregistrées. Exécutez le fichier par lots en cliquant avs_creator.
bat pour convertir la vidéo compressée AVI en format lisible pour ImageJ. La macro peut être chargée simplement en faisant glisser et tomber dans une coque graphique d’interface utilisateur. Cette macro permettra certains hotkeys pour l’analyse suivante.
Dans l’annuaire de travail, créez un nouveau dossier et nommez-le Process_ImageJ. Ce dossier sera automatiquement utilisé pour stocker les fichiers de sortie de l’analyse suivante. Cliquez à droite sur le fichier vidéo AVS pour analyser et sélectionner la monture rapide.
Une fois que le fichier AVS est monté en tant que lecteur externe, ouvrez le fichier AVI dans ImageJ. Pour définir l’échelle de la mesure de distance, sélectionnez le diamètre de la chambre d’essai en dessinant une ligne droite à travers la chambre à l’aide de l’outil de sélection en ligne droite, puis définissez l’échelle en cliquant sur analyser, définir la fonction échelle. Pour notre cas, nous enrions 9,4 centimètres.
Cochez la boîte radio de global afin de normaliser l’échelle à travers toute l’analyse vidéo suivante. Copiez la zone de la chambre d’analyse en utilisant l’outil de sélection ovale, puis cliquez à droite et sélectionnez l’image en double. Pour l’instant, spécifiez la plage de cadres à conserver pour une analyse plus approfondie.
Effacer à l’extérieur de la chambre d’analyse et convertir l’image en une image binaire en frappant le hotkey sept sur la barre de nombre. Une fois l’arrière-plan dégagé, vous serez invité à ajouter un point noir au centre pour indiquer la position de la tige de verre vibrante en utilisant l’outil de sélection ovale déjà mis en noir avec la fonction de remplissage. Cliquez sur OK et la macro vous invitera à passer à l’ajustement du seuil.
Ajustez le seuil de sorte que le poisson soit en mesure d’être vu tout au long du clip vidéo, puis sélectionnez appliquer. Exécutez tracker plug-in en frappant le hotkey huit sur la barre de nombre. Réglez la taille minimale des pixels à 100, lorsqu’il est invité.
Ce processus générera la distance entre la tige de verre vibrante et le poisson par image pour les trois minutes de la vidéo binaire. Pour enregistrer le fichier tracker, appuyez sur le hotkey neuf sur la barre des nombres. Cela permettra d’exporter automatiquement une pile binaire d’images de l’ensemble de la vidéo et un fichier XLS avec des coordonnées et des données à distance, au cas où il est nécessaire de réanalyser.
Cela permettra également de fermer tous les fichiers associés à la vidéo en cours. Les fichiers générés peuvent maintenant être analysés en fonction de la question de recherche spécifique. Acclimatez cinq poissons expérimentaux pendant quatre jours ou plus dans chaque chambre d’un aquarium d’enregistrement acrylique personnalisé de conception de 10 litres rempli d’eau conditionnée.
Chaque chambre est séparée par une planche acrylique noire. Chaque réservoir doit être couvert pour empêcher les poissons de sauter dans une autre chambre. Réglez la mise à jour programmable de la programmable pour allumer automatiquement la lumière LED blanche pendant 12 heures et éteindre pendant 12 heures par jour pendant la période d’acclimation.
Cela entrainera le rythme circadien du poisson si le poisson est sensible à l’entraînement. Afin de fournir une lumière blanche plus diffuse, nous utilisons une planche acrylique opaque blanche plate de dimension similaire au réservoir de 10 litres comme diffuseur pour passer la lumière à travers pour chaque réservoir. Pendant cette période, fournir une fois par jour l’alimentation avec des crevettes saumures vivantes et fournir une aération par filtre éponge dans chaque aquarium.
Notez, assurez-vous que les poissons sont nourris en temps régulier. Par exemple, une fois par jour le matin. La veille du jour de l’essai, trois jours ou plus d’aclimation, remplacez l’eau dans la chambre d’essai par de l’eau fraîchement conditionnée.
Définissez l’enregistrement des paramètres dans le logiciel VirtualDub. La vidéo sera enregistrée en 15 images par seconde dans le temps d’exposition fixe. La vidéo est compressée en codec X264VFW pour obtenir environ 700 fois la compression.
Le jour de l’enregistrement, nourrir chaque poisson avec des crevettes saumures vivantes. Retirez tout filtre éponge et commencez à enregistrer. Allumez la lumière infrarouge à l’étape de l’enregistrement.
En observant virtualdub image en direct à l’écran, ajuster la position de chaque aquarium pour s’assurer qu’ils font face à la caméra USB correctement. Commencez l’enregistrement 24 heures sur 24 le matin. Par exemple, l’heure de début est de 9 .m.
et le temps d’arrivée est de 9 .m le lendemain. Commencez à capturer la vidéo et sécuriser l’emplacement pour éviter les perturbations.
Vérifiez occasionnellement si l’enregistrement est en cours d’exécution. Après 24 heures d’enregistrement, assurez-vous que la vidéo a été enregistrée correctement. Transférez la vidéo au poste de travail du PC pour suivre le comportement du poisson.
Après avoir transféré la vidéo dans le dossier approprié, faites rapidement un contrôle de qualité de la vidéo pour vous assurer qu’elle est de bonne qualité. Cela comprend regarder l’éclairage, vérifier s’il ya un poisson dans chaque section, et s’il ya des mouvements étrangers qui peuvent causer un mauvais suivi. De là, le freeware SwisTrack est utilisé pour le suivi des animaux.
L’avantage de ce logiciel est que le logiciel peut suivre plusieurs animaux à la fois et soustraire l’image de fond en utilisant un cadre arbitraire que nous identifions. Les inconvénients sont que le suivi peut sauter entre les arènes contenant un poisson différent. L’image d’arrière-plan peut ne pas être suffisante pour les cadres ultérieurs, et SwisTrack attribue aléatoirement l’id de suivi à chaque poisson, il est donc nécessaire de récupérer l’ID des poissons en traçant la position physique moyenne de chaque poisson.
Pour surmonter ces problèmes, trois approches sont utilisées. L’utilisation de masques binaires, l’un pour le suivi des arènes numérotées, et l’autre pour le suivi des arènes impaires. L’utilisation de Win-automation pour mettre à jour automatiquement les images de fond toutes les trois minutes et l’utilisation de scripts Perl pour reconstruire les ID de poisson.
La première étape de l’analyse est de faire les masques binaires pour les arènes impaires et même. Après avoir vérifié la qualité de la vidéo, choisissez un cadre représentatif dans un logiciel de montage vidéo et utilisez-le pour créer deux masques binaires, l’un pour les arènes à nombres impairs. Le but de ces masques binaires est d’éviter les erreurs de suivi entre les arènes adjacentes.
Après avoir fait des masques binaires, ouvrez les fichiers de paramètres SwisTrack qui déterminent les chemins de fichiers et les paramètres du processus de suivi. Préparez un fichier de paramètres dans chacun des dossiers de fichiers even and odd pour le suivi vidéo. Dans ce fichier, tapez le chemin vers les emplacements de fichiers de la vidéo et masquez les fichiers.
Après avoir préparé les fichiers de paramètres, ouvrez le fichier exécutable Win-automation qui réinitialise automatiquement l’arrière-plan toutes les trois minutes. Avec ce fichier exécutable, SwisTrack s’exécutera automatiquement, puis ouvrira le fichier de paramètres dans chaque dossier même ou impair dans ce logiciel de suivi. Exécutez le logiciel de suivi pour suivre le mouvement des poissons.
Dans les 9 000 premiers cadres de suivi, assurez-vous que les poissons sont correctement suivis en regardant le composant de suivi voisin le plus proche. Après avoir bien établi le suivi, retournez à l’onglet composant de soustraction d’arrière-plan adaptatif et appuyez sur le R hotkey sur le clavier pour exécuter Win-automation pour la soustraction adaptative continue de fond. Après environ cinq heures, des fichiers texte sont générés pour chaque poisson, contenant des coordonnées X et Y pour chaque image de la vidéo.
Pour poursuivre l’analyse, allouez les trois fichiers de script Perl au dossier qui inclut à la fois des dossiers différents et impairs. Afin de convertir la longueur en pixels en centimètres, il est nécessaire de connaître le rapport centimètre/pixel. Tapez ce ratio à l’emplacement approprié du fichier de script Perl nommé 1.fillupGaps.pl.
Exécuter 1.fillupGaps. pl Script Perl à l’aide d’un émulateur Unix pour Windows. Tout d’abord, utilisez la commande CD pour passer à l’annuaire de travail actuel, puis tapez Perl 1.fillupGaps.
pl pour exécuter le script Perl. Les deux autres scripts seront automatiquement appelés dans l’ordre séquentiel. Ces trois scripts attribuent chaque fichier de suivi à chaque section de l’aquarium, et peuvent donc être utilisés pour analyser le comportement de chaque poisson.
Conférer avec le fichier texte nommé Summary_Sleep qui est généré après l’exécution des scripts pour vérifier que le nombre d’images supprimées de l’analyse est inacceptable faible. Manquer moins de 15% des cadres est considéré comme acceptable. Copiez et coller des données de suivi dans un fichier de feuille de calcul avec une macro interne.
Cette macro restructurera les données analysées en plusieurs niveaux de processus en étapes, tels que la durée moyenne du sommeil et la somme de la distance de natation. Afin de tacher la ligne latérale des poissons, dissoudre la solution de stock DASPEI dans de l’eau conditionnée pour une concentration finale de cinq microgrammes par millilitre, puis plonger le poisson dans la solution à température ambiante dans un environnement sombre pendant 45 minutes. Après 45 minutes, récupérer le poisson de la solution DASPEI et l’immerger dans de l’eau glacée conditionnée avec mes triple deux.
Une fois que le poisson est profondément anesthésié, montez le poisson dans une boîte de Pétri et observez-le au microscope efficace. Assurez-vous de prendre une série statistique pour inclure tous les plans du poisson au point et compiler tout dans une seule image. Pour l’analyse d’image, ajoutez un nouveau dossier intitulé Process_ImageJ et le fichier macro au dossier contenant les images à analyser.
Ouvrez le logiciel ImageJ, puis ouvrez la macro en faisant glisser le fichier macro vers ImageJ. Exécutez macro en cliquant sur macros, exécuter macro. Si l’image ne s’ouvre pas automatiquement, cliquez sur macro, collecte de fichiers.
Macro va ensuite automatiquement ramasser un fichier d’image à analyser. Pour la quantification neuromast montre la région d’intérêt en cliquant sur polygone deux, et dessiner la zone sur l’image. Huit, cinq pour dupliquer la région d’intérêt.
Utilisez l’outil de peinture pour supprimer ou ajouter tout point qui est supplémentaire ou manquant de l’image précédente, puis huit, six. Une fois que vous huit, six, deux nouvelles fenêtres apparaîtront. Une fenêtre montrant un schéma de points neuromast numérotés et une fenêtre avec une table avec neuromast total quantifié.
Frappez sept pour enregistrer les deux fichiers. Une fois que vous cliquez sur OK, ces fichiers sont stockés et un nouveau fichier d’image s’ouvrira pour une analyse plus approfondie. Consolider le nombre de neuromast en exécutant macro.
Les résultats suivants sont des résultats représentatifs de ce à quoi on peut s’attendre pour les deux morphs de poissons dans des conditions contrôlées. Ces quatre chiffres montrent des résultats représentatifs des analyses de comportement d’attraction vibratoire. A et B sont les meilleures vues sur le chemin de baignade de A, un poisson de surface, et B un poisson des cavernes.
Les lignes rouges sont les traces des coordonnées générées par le suivi ImageJ sur trois minutes d’enregistrement. C et D montrent une comparaison des résultats de C, un poisson de surface, et D, un poisson des cavernes, extrait par la macro feuille de calcul des fichiers TXT. L’axe Y est le nombre compté de fois où le poisson s’est approché de la tige vibrante.
Chaque point représente une observation expérimentale lors de l’analyse comportementale d’un poisson. Notez que les poissons de surface ne montrent pas une augmentation des approches à n’importe quelle fréquence, tandis que les poissons des cavernes montrent un maximum d’attraction autour de 35 à 40 Hertz. Ces deux chiffres montrent des résultats représentatifs des analyses de comportement du sommeil extraites par les macros de feuille de calcul des fichiers TXT.
A et B démontrent deux des mesures automatiquement résumées par le fichier macro. La figure A montre la distance de baignade de jour et de nuit pour les poissons de surface et les poissons des cavernes, tandis que B montre la durée du sommeil pour les deux morphes. Dans ce cas, le poisson des cavernes a montré une hyperactivité et moins de sommeil par rapport aux poissons de surface.
Ces chiffres montrent les résultats de l’analyse d’image DASPEI extraite par la macro feuille de calcul des fichiers TXT. A et B démontrent la relation entre le nombre de neuromast versus le comportement d’attraction de vibration et la taille de neuromast contre le comportement dans le poisson de caverne, le poisson de surface, et la progéniture de F1. Chaque point représente chaque poisson.
Notez, le nombre de neuromast est positivement corrélé avec le comportement d’attraction de vibration, suggérant que le neuromast puisse régler ce comportement. Neuromast taille soutient également cette conclusion. C et D sont des images d’exemple de neuromast taché DASPEI de C, un poisson de surface, et D, un poisson des cavernes.
Chaque point fluorescent dans les images est un neuromast, qui a pris DASPEI. Notez, l’abondance sensiblement plus grande de neuromasts sur le poisson des cavernes. Nous avons montré une série d’analyses de comportement pour l’activité latérale de natation de comportement basée sur la ligne et le sommeil.
Le système de suivi des animaux peut également être adapté à d’autres comportements, tels que les comportements répétitifs stéréotypés, les interactions sociales et la latéralité comportementale.
