Ce travail est soutenu par une subvention du US National Science Foundation à Christoph Benning.

1. L&#39;extraction des lipides <ol><li> Commencez l&#39;extraction des lipides par la récolte de 30 mg feuilles d&#39;Arabidopsis 4 semaines d&#39;âge à partir de plantes cultivées sur gélose solidifiée moyen ou le sol et les transférer dans des tubes de 1,5 ml en polypropylène réaction. Les feuilles fraîches peuvent être éclair congelés dans l&#39;azote liquide et stockés à -80 ° C. </li><li> Ajouter 300 uL d&#39;extraction solvant composé de méthanol, le chloroforme et l&#39;acide formique (20:10:01, v / v / v) pour chaque échantillon. Agiter vigoureusement (à l&#39;aide d&#39;une peinture ou un shaker similaire) pendant 5 minutes. </li><li> Ajouter 150 ul de 0,2 M d&#39;acide phosphorique (H 3 PO 4), 1 M de chlorure de potassium (KCl) et brièvement au vortex. </li><li> Centrifuger à 13000 xg à température ambiante pendant 1 minute. Les lipides dissous dans la phase inférieure chloroformique seront déposés sur des plaques de CCM. </li></ol> 2. Chromatographie sur couche mince (CCM) 15 <ol><li> Pour préparer des plaques de CCM, immerger un gel de silice TLC 20cmx20cm plaque recouverte de chargement de bande de 30 sec en sulfate d&#39;ammonium 0,15 M ((NH 4) 2 SO 4) solution, après avoir submergé pendant 30 secondes, sèche la plaque pendant au moins 2 jours dans un récipient couvert. Lors de l&#39;activation de la sublimation de l&#39;ammonium laisse derrière lui l&#39;acide sulfurique, qui protone phosphatidylglycérol nécessaires à sa séparation d&#39;avec les autres glycérolipides. </li><li> Le jour de l&#39;expérience, d&#39;activer TLC plaques par cuisson dans un four à 120 ° C pendant 2,5 heures. </li><li> Après refroidissement les plaques activées à la température ambiante, utilisez un crayon pour dessiner une ligne droite (1,5 cm du bord de la plaque) sur la plaque à l&#39;origine du chromatogramme. </li><li> Dans une hotte, lentement livrer 3 X 20 pi d&#39;extrait lipidique dans la phase inférieure chloroformique aide d&#39;une pipette 20 pl avec 200 pi jaunes pointes en plastique sous un faible courant de N 2. À cette fin, un tube Tygon est relié au régulateur de la N 2 réservoir. Gardez le spot inférieure à 1 cm de diamètre. Chaque plaque peut contenir jusqu&#39;à 10 échantillons (lorsque l&#39;analyse ultérieure GLC est prévu). </li><li> Comme les lipides taches complètement sec dans la hotte, préparer le solvant de développement composé d&#39;acétone, de toluène, de l&#39;eau (91 ml: 30 ml: 7,5 ml). Si l&#39;humidité de l&#39;air ambiant relative est élevée, la séparation pourrait être affectée. Dans ce cas, l&#39;eau doit être réduite pour donner (91 ml: 30 ml: 7,0 ml) pour obtenir la séparation souhaitée. </li><li> Verser 80 ml solvant de développement dans un TLC refermable développement de chambre (L: H: W = 27,0: 26,5: 7,0, cm / cm / cm) et placer la plaque dans la cuve avec la fin de l&#39;échantillon vers le bas. Sceau de la cuve à l&#39;aide de la pince. Le solvant montera sur le plateau et les lipides seront séparés. Le temps de développement est d&#39;environ 50 minutes à température ambiante. </li><li> Lorsque le front du solvant a atteint 1 cm du haut de la plaque, enlevez soigneusement la plaque de la cuve et le sécher dans la hotte pendant 10 minutes environ. </li><li> Lipides séparés par CCM peut être réversible teinté brièvement avec de l&#39;iode pour l&#39;analyse quantitative ou irréversiblement coloré avec l&#39;acide sulfurique ou α-naphtol. <ol><li> Carbonisation d&#39;acide sulfurique: la plaque de pulvérisation avec de l&#39;acide sulfurique à 50% dans de l&#39;eau dans un vaporisateur en verre dans la hotte et cuire au four à 120 ° C pendant 15 minutes (figure 2A). </li><li> α-naphtol coloration pour glycolipides: pulvériser la plaque avec 2,4% (p / v) α-naphtol dans 10% (v / v) d&#39;acide sulfurique, 80% (v / v) d&#39;éthanol et cuire au four à 120 ° C pendant 3-5 minutes jusqu&#39;à ce que les bandes glycolipide sont colorés roses ou pourpres (figure 2B). Surtraitement mènera à la carbonisation de toutes les lipides due à la présence d&#39;acide sulfurique dans le réactif. </li><li> Coloration à l&#39;iode: dans une hotte, placer la plaque dans une cuve fermée avec TLC cristaux d&#39;iode (dans un bac sur le fond conduisant à une saturation de l&#39;atmosphère avec la vapeur d&#39;iode jusqu&#39;à ce lipides sont visibles). Ne pas exposer la plaque à l&#39;iode trop longtemps que l&#39;iode peut modifier de façon covalente des acides gras polyinsaturés (figure 2C). Sinon, pour éviter toute oxydation des lipides, des voies réservées aux standards entrecoupées de ruelles échantillon doit être teinté en utilisant une laine de verre bouché pipette Pasteur avec des cristaux d&#39;iode à travers lequel le N 2 est soufflé individuels voies standard. </li></ol></li></ol> 3. Acyl ester méthylique (FAME) Réaction 16 <ol><li> Retirez la silice entourant taches lipides identifiés à partir de la plaque de CCM avec une lame de rasoir. Grattez la silice et le transfert lipidique contenant la poudre de silice en utilisant un entonnoir dans un tube en verre avec un bouchon à vis en téflon (PTFE)-alignés. </li><li> Ajouter 1 mL 1 N d&#39;acide chlorhydrique (HCl) dans le methanol anhydre pour chaque échantillon en verre pipette. </li><li> Ajouter 100 uL 50 pg ml -1 pentadécanoïque acide (15h00) avec 200 uL pipette pour chaque échantillon comme étalon interne à l&#39;aide d&#39;une pipette 200 ul avec 200 uL embout en plastique jaune. Gardez un tube avec seulement l&#39;acide pentadecenoic de HCl méthanolique comme un contrôle. Fermer les tubes en verre hermétiquement avec téflon bouchons. </li><li> Incuber gltubes cul dans une 80 ° C bain-marie pendant 25 minutes. Tubes doivent être scellés de telle sorte que le solvant ne s&#39;évapore pas. </li><li> Après les tubes ont refroidi, ajouter 1 ml de chlorure de sodium à 0,9%, suivi par une mL d&#39;hexane et vortexer vigoureusement. Centrifuger les échantillons à 1000xg pendant 3 minutes. </li><li> Dans la hotte, enlever la couche d&#39;hexane / supérieure de l&#39;échantillon avec une pipette Pasteur et le placer dans un nouveau tube en verre 13x100 mm. </li><li> Evaporer l&#39;hexane sous un faible courant de N 2 sans sécher complètement. </li><li> Dissoudre le résultant acyl esters méthyliques s dans 60 uL d&#39;hexane. Transfert des échantillons dans des flacons échantillonneur automatique et bouchon. Les échantillons peuvent être conservés à 4 ° C pour le court terme et -20 ° C pendant quelques jours. </li></ol> 4. Chromatographie gaz-liquide (GLC) 10 <ol><li> Avant de commencer GLC, s&#39;assurer que l&#39;hélium, l&#39;hydrogène et des bouteilles d&#39;air sont remplis. </li><li> Hexane suffisante doit être ajoutée au réservoir de solvant et le conteneur à déchets doit être vide. Pour la séparation gras esters méthyliques d&#39;acyle, joignez une DB-23 colonne à la machine. </li><li> Placez les flacons dans l&#39;échantillonneur automatique. Démarrez le logiciel Chemstation pour GLC sur l&#39;ordinateur du système. </li><li> Réglez la température d&#39;entrée à 250 ° C avec un débit d&#39;hélium à 48,6 mL -1 min et la pression à 21.93 psi. Le rapport de division est de 30,0: 1. </li><li> La température du four est fixé initialement à 140 ° C pendant 2 min et porté à 160 ° C à une vitesse de 25 ° C min -1. Ensuite, réglez la température pour augmenter de 160 ° C à 250 ° C à une vitesse de 8 ° C min -1 et maintenir à 250 ° C pendant 4 min suivie d&#39;une baisse à 140 ° C à une vitesse de 38 ° C min - 1. Une descente prend environ 21 minutes. </li><li> La température du détecteur à ionisation de flamme est de 270 ° C avec un débit d&#39;hydrogène de 30,0 ml min -1, débit d&#39;air à 400 mL -1 min et le débit de l&#39;hélium à 30,0 mL -1 min. </li><li> Entrez le nombre de flacons et les noms de l&#39;échantillon dans le tableau séquence d&#39;exécution. Réglez l&#39;injecteur 10 uL d&#39;injecter un échantillon de 2 l par flacon. </li><li> Lorsque l&#39;instrument est prêt, lancer la séquence de courir. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Exemples de coloration irréversible des TLC séparés lipides à partir de plants d&#39;Arabidopsis 4 semaines d&#39;âge sont représentées dans la figure 2. Les lipides d&#39;acide sulfurique coloré (figure 2A) sont carbonisés et apparaissent comme des taches brunes. α-naphtol est préférable de teindre des glycolipides tels que MGDG, DGDG, SQDG glycolipides etc colorés avec α-naphtol mener une couleur rose-violet tandis que d&#39;autres lipides polaires tache jaune (figure 2B). La coloration à l&#39;iode est réversible et donne une couleur jaunâtre lipides qui vont disparaître sur une courte période comme l&#39;iode s&#39;évapore (figure 2C). Lipides d&#39;iode brièvement tachés peuvent être soumises à une analyse GLC bien lipides non colorés sont préférables pour réduire briser des lipides. Si c&#39;est fait avec succès, des signaux distinctifs représentant différents acyl ester méthylique sera observée après CGL (figure 3). Fatty ester méthylique d&#39;acyle avec la chaîne carbonée plus courte et moins de doubles liaisons ont temps de rétention en utilisant le DB-23 de la colonne. Acyl ester méthylique de profilage est un outil sensible pour identifier les mutants avec la composition lipidique altéré. Dans la figure 4, la MGDG18: 3 ratio d&#39;acides gras molaire est diminué chez le mutant tgd4-1 par rapport au type sauvage 18. En divisant les moles de acyl ester méthylique pour une classe de lipides avec les taupes de toutes les classes de lipides, le rapport molaire de chaque lipide sont calculés. Par exemple, pour calculer le ratio molaire de MGDG: (MGDG) mol% =% x100 Σ [FAME (MGDG)] / Σ [FAME (total)] Les ratios molaires résultant de chaque classe de lipides à la fois du type sauvage et le mutant peut être comparé. Par exemple, le mutant tgd4-1 a augmenté les quantités relatives de la MGDG et PG, mais diminué des montants de DGDG et PE (figure 5) 18. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Organigramme Figure 1. De l&#39;analyse des lipides polaires en utilisant des plants d&#39;Arabidopsis. Les lipides totaux sont extraits des plants d&#39;Arabidopsis de 4 semaines, âgé et séparés par CCM. Les lipides peuvent être séparés raclées plaque de CCM pour la transestérification suivie par l&#39;analyse GLC. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Séparation des lipides sur des plaques de CCM. Extraits lipidiques de 35 mg (poids frais) des plants de type sauvage sont séparés par CCM et colorées par l&#39;acide sulfurique (A), α-naphtol (B) ou des vapeurs d&#39;iode (C). Trois répétitions sont indiquées dans chaque méthode de coloration. DGDG, digalactosyldiacylglycérol; MGDG, monogalactosyldiacylglycérol; PC, la phosphatidylcholine, PE, la phosphatidyléthanolamine, PG, phosphatidylglycerol; PI, phosphatidylinositol; SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Analyse GLC d&#39;esters méthyliques d&#39;acides gras (FAME) dérivés de MGDG de type sauvage. FAME sont séparés sur une colonne capillaire de 30 m et détectés par ionisation de flamme. Pentadécanoïque acide (15:00) est utilisé comme standard interne. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Profil des acides gras MGDG dans le type sauvage Col2 (colonnes blanches) et les tgd4-1 mutante (colonnes noires). Les acides gras sont présentées comme le nombre de carbones suivie par le nombre de doubles liaisons. Trois répétitions sont en moyenne et les écarts types sont représentés. <img src="/files/ftp_upload/2518/2518fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Polar composition des lipides de type sauvage Col2 (colonnes blanches) et les tgd4-1 mutante (colonnes noires). Trois répétitions sont en moyenne et les écarts types sont représentés par des barres d&#39;erreur.

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TLC couplé avec CGL offre un outil robuste et rapide pour l&#39;analyse quantitative des lipides polaires dans les plantes. De petits changements dans la composition lipidique peut être identifié, par conséquent, cette méthode a été utilisée pour le dépistage à grande échelle des mutants déficients dans les régions polaires des voies métaboliques des lipides 1,20. Cette méthode est également largement utilisé pour les activités de surveillance des enzymes utilisant des lipides polaires comme substrat. 2,6,7 Outre les feuilles, la composition lipidique des autres tissus végétaux comme les racines et les graines ou les fractions subcellulaires comme les chloroplastes et les mitochondries peuvent également être déterminés de la même manière. Le système de solvants (acétone, toluène, eau) utilisé ici est optimisé pour la séparation des glycolipides et des phospholipides dans les plantes. Cependant, dans tgd1, 2,3,4 mutants et les chloroplastes isolés, TGDG s&#39;exécute avec PE tandis tetragalactosyldiacylglycerol fonctionne avec un PC. Dans ce cas, un système de solvant avec du chloroforme, le méthanol, l&#39;acide acétique et de l&#39;eau (85: 20: 10: 4, v / v / v / v) est utilisé 13. Parfois deux dimensions TLC en utilisant deux différents systèmes de solvants est effectué pour d&#39;autres glycolipides et des phospholipides séparés 19. En outre, les tissus de la plante peuvent être directement soumis à la réaction suivie par GLC FAME pour déterminer le profil des acides gras totaux sans séparation initiale sur TLC 5. A côté de la CCM ont démontré GLC-système, une autre méthode utilisée pour le profilage des lipides est basé sur la masse d&#39;ionisation électrospray directe tandem de spectrométrie 17. Dans cette méthode, la séparation chromatographique initiale de lipides dans l&#39;extrait est omise. Cependant, cette méthode nécessite un équipement coûteux et un personnel expérimenté, ce qui rend moins utile pour des analyses de routine en laboratoire ou pour le dépistage mutant.

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>&alpha;-naphthol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>N1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methanolic HCL 3N</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>33050-U</td>
<td>Dilute to 1N by methanol</td>
</tr>
<tr>
<td>Si250-PA TLC plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>J.T.Baker</td>
<td>7003-04</td>
<td>With pre-absorbent </td>
</tr>
<tr>
<td>TLC chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>Z266000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Screw cap tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>53283-800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scew caps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sun Sri</td>
<td>13-425</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PTFE disk</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sun Sri</td>
<td>200 608</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GLC system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hewlett Packard</td>
<td>HP6890</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DB-23 column</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>J&amp;W Scientific</td>
<td>122-2332</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GLC vials</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sun Sri</td>
<td>500 132</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Caps of GLC vials</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sun Sri</td>
<td>201 828</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chemstation software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>G2070AA</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
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arabidopsis thaliana polar glycerolipid profiling by thin layer chromatography (tlc) coupled with gas-liquid chromatography (glc)

Biologique des cellules des membranes distincte de l&#39;environnement. D&#39;une cellule unique pour les plantes et les animaux multicellulaires, glycérolipides, tels que la phosphatidylcholine ou la phosphatidyléthanolamine, membranes bicouches forme qui agissent à la fois comme des limites et des interfaces pour l&#39;échange chimique entre les cellules et leur environnement. Contrairement aux animaux, les cellules végétales ont un organite spéciale pour la photosynthèse, les chloroplastes. Le système de membrane du chloroplaste complexes glycérolipides contient uniques, à savoir glycolipides manque de phosphore: monogalactosyldiacylglycérol (MGDG), digalactosyldiacylglycérol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG) 4. Les rôles de ces lipides sont tout simplement au-delà des structures. Ces glycolipides et glycérolipides autres ont été trouvés dans les structures cristallines du photosystème I et II indiquant l&#39;implication de glycérolipides dans la photosynthèse 8,11. Pendant la famine de phosphate, DGDG est transféré sur des membranes extraplastidic pour compenser la perte de phospholipides 9,12. Une grande partie de notre connaissance de la biosynthèse et la fonction de ces lipides a été dérivé d&#39;une combinaison d&#39;études génétiques et biochimiques de 14 Arabidopsis thaliana. Durant ces études, une procédure simple pour l&#39;analyse des lipides polaires a été essentiel pour le dépistage et l&#39;analyse des lipides et des mutants seront décrites en détail. Un extrait lipidique des feuilles est d&#39;abord séparés par chromatographie sur couche mince (CCM) et glycérolipides sont colorées de manière réversible avec la vapeur d&#39;iode. Les lipides individuels sont grattées de la plaque de CCM et convertis en esters méthyliques gras acyle (FAME), qui sont analysés par chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur à ionisation de flamme (FID-GLC) (figure 1). Cette méthode a été prouvée pour être un outil fiable pour le dépistage du mutant. Par exemple, le tgd1, 2,3,4 réticulum endoplasmique-à-plastes mutants trafic de lipides ont été découvertes basées sur l&#39;accumulation d&#39;une galactoglycerolipid anormale: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) et une diminution de la quantité relative de 18h03 (carbones: double obligations) groupes acyle gras dans les lipides de la membrane 3,13,18,20. Cette méthode est également applicable pour la détermination des activités enzymatiques de protéines en utilisant des lipides comme substrat 6.

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Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography TLC Coupled with Gas-Liquid Chromatography GLC

Composition des extraits lipidiques polaires et la composition en acides gras de glycérolipides individuels sont déterminés dans une expérience de profilage des lipides simples et robustes. À cette fin, glycérolipides sont isolés par chromatographie sur couche mince et soumis à transméthylation de leurs groupes acyle. Fatty acyl esters méthyliques sont quantifiés par chromatographie gaz-liquide.

Arabidopsis thaliana profilage glycolipides polaires par chromatographie sur couche mince (CCM) couplée à la chromatographie gaz-liquide (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as ...

arabidopsis-thaliana-polar-glycerolipid-profiling-thin-layer

Research

JoVE Journal

Biology

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

36.4K vues.  Michigan State University. Composition des extraits lipidiques polaires et la composition en acides gras de glycérolipides individuels sont déterminés dans une expérience de profilage des lipides simples et robustes. À cette fin, glycérolipides sont isolés par chromatographie sur couche mince et soumis à transméthylation de leurs groupes acyle. Fatty acyl esters méthyliques sont quantifiés par chromatographie gaz-liquide.

Vidéo: Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography TLC Coupled with Gas-Liquid Chromatography GLC

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

Préparation des échantillons MALDI: la méthode de la couche ultra mince

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Recherche

Biologie

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

Étude des tissus et des organes spécifiques Réponses phytochrome utilisant FACS assistée type cellulaire profilage expression spécifique dans Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&amp;#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

Floral-pendage de la transformation Arabidopsis thaliana Pour examiner PTSO2:: β-glucuronidase Expression du gène rapporteur

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Isolation efficace et rapide des embryons à un stade précoce de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Graines

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

La coloration histochimique de l&#39;<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Cellule secondaire Elements mur

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light conditions, which are preferably variable in quantity and quality so that studies under different setups can be conducted. These requirements are met by climatic chambers featuring light emitting diodes (LED) lights, which can &#8211; in contrast to fluorescent lights &#8211; be set to different wavelengths. LEDs are energy conserving and emit virtually no heat even at light intensities, which often constitutes a problem with other light sources. The presented protocol provides a step-by-step guidance of how to program a climatic chamber equipped with variable LED lights as well as describing several approaches for in depth analysis of growth phenotypes. Depending on the experimental set-up various characteristics of the growing plants can be observed and analyzed. Here we describe how to determine fresh weight, leaf area, photosynthetic activity, and stomatal density. We demonstrate that in order to obtain reliable data and draw valid conclusions it is mandatory to use a sufficient number of individuals for statistical evaluation. Taking too few plants for this kind of analysis results in high statistical errors and consequently in less clear interpretations of the data.

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Here, we present a protocol for studying plant growth behavior and especially phenotypes in a reproducible manner. We show how to provide variable and at the same time stable light conditions. Proper analyses depend on sufficient sample numbers and valid statistical evaluations.

Analyse des comportements de croissance Arabidopsis thaliana dans différentes qualités de lumière

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli (p)ppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in seconds, which leads to accumulation of levels that approach or exceed those of GTP pools. Stress reversal occasions a rapid disappearance of (p)ppGpp, often with a half-life of less than a minute. The presence of (p)ppGpp results in alterations of cellular gene expression and metabolism that counter the damaging effects of stress. Gram-negative and Gram-positive bacteria have different response mechanisms, but both depend on (p)ppGpp concentration. In any event, there is a need to simultaneously monitor many radiolabeled bacterial cultures at time intervals that may vary from 10 seconds to hours during critical stress transition periods. This protocol addresses this technical challenge. The method takes advantage of temperature- and shaker-controlled microtiter dish incubators that allow parallel monitoring of growth (absorbance) and rapid sampling of uniformly phosphate-radiolabeled cultures to resolve and quantitate nucleotide pools by thin-layer chromatography on PEI-cellulose. Small amounts of sample are needed for multiple technical and biological replicates of analyses. Complex growth transitions, such as diauxic growth and rapid (p)ppGpp turnover rates can be quantitatively assessed by this method.

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

The growth of radiolabeled bacterial cultures in microtiter dishes facilitates high throughput sampling that allows multiple technical and biological replicate assays of nucleotide pool abundance, including that of (p)ppGpp. The effects of growth transitions provoked by sources of physiological stress as well as recovery from stress can be monitored.

Utilisation de Microtiter Dish Radiolabeling pour plusieurs mesures in vivo d'Escherichia coli (p)ppGpp Suivi par thin Layer Chromatography

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in ...

Etude spatio-temporelle de la dynamique d’ERL1 via l’imagerie confocale

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane system. This includes the secretory transport of newly synthesized proteins to the cell surface or the outside of the cell, the endocytic transport of extracellular cargoes or plasma membrane components into the cell, and the recycling or shuttling transport of cargoes between the subcellular organelles, etc. Membrane trafficking events are crucial to the development, growth, and environmental adaptation of all eukaryotic cells and, thus, are under stringent regulation. Cell-surface receptor kinases, which perceive ligand signals from the extracellular space, undergo both secretory and endocytic transport. Commonly used approaches to study the membrane trafficking events using a plasma membrane-localized leucine-rich-repeat receptor kinase, ERL1, are described here. The approaches include plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup. To monitor the spatiotemporal regulation of ERL1, this study describes the co-localization analysis between ERL1 and a multi-vesicular body marker protein, RFP-Ara7, the time series analysis of these two proteins, and the z-stack analysis of ERL1-YFP treated with the membrane trafficking inhibitors brefeldin A and wortmannin.

Pleins feux sur l’auteur : Méthodes basées sur l’image pour étudier les événements de trafic membranaire dans les cellules de la lignée stomatique  

Several commonly used methods are introduced here to study the membrane trafficking events of a plasma membrane receptor kinase. This manuscript describes detailed protocols including the plant material preparation, pharmacological treatment, and confocal imaging setup.

Méthodes basées sur l’image pour étudier les événements de trafic membranaire dans les cellules de la lignée stomatique

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...