Ce travail a été soutenu par la Science Foundation NSF-IOS subvention nationale # 1144391 de SHB.

1. Préparation des plantes <ol><li> Graines d&#39;Arabidopsis peuvent être mises à germer directement sur ​​le sol ou sur des plaques de SEP. Cultiver les plantes pour quatre à six semaines dans des chambres de croissance avec une photopériode de 12 heures (22 ° C le jour, 15 ° C la nuit 14). Arrosez les plantes une à deux fois par semaine. Utilisez le tiroir du bas pour l&#39;arrosage, ne pas les plantes aquatiques à partir du haut; permettent aux plateaux sécher avant de re-arrosage. Assurez-vous que les plantes sont bien hydratés au moment de la récolte. </li></ol> 2. Préparation des solutions et plats <ol><li> Solution 2-EDTA K: Faire une solution 100 mM K 2-EDTA solution actions, qui peut être conservé au réfrigérateur. Le jour de la collecte, diluer la solution à un à cinq (une solution EDTA partie, quatre parties d&#39;eau) pour obtenir une solution 20 mM de 2-EDTA K. </li><li> Remplir un verre ou une boîte de Pétri (diamètre 7-15 cm) à mi-chemin avec le 20 mm solution 2-EDTA K. Si la collecte d&#39;échantillons de différents traitements (par explantes sel de stress ou de différents génotypes ample contrôle et), préparent des plats séparés pour chaque traitement. </li><li> Remplissez nombre désiré de 1,7 tubes de réaction ml à 1,4 ml de solution à 20 mM K 2-EDTA. Remplir un nombre égal de tubes de réaction avec 1,4 ml d&#39;eau désionisée ou autoclavés Millipore. </li><li> Mettez des serviettes en papier sur le banc de mettre des plantes sur; obtenir une lame de rasoir neuve et mettre des gants. </li></ol> 3. Collection de phloème exsudats (représentée dans le diagramme de la figure 1) <ol><li> Rosette de récolte feuilles de quatre à six semaines d&#39;âge plantes en les coupant avec la lame de rasoir à la base du pétiole à proximité du centre de la rosette. </li><li> Immédiatement placer les feuilles dans les boîtes contenant 20 mM K 2-EDTA. Assurez-vous que la fin de la coupe du pétiole est immergée dans la solution (Figure 2). </li><li> Une fois 15 feuilles ont été collectés (environ trois à quatre plantes), empiler les feuilles délicatement sur le dessus de l&#39;autre de telle tpétioles le chapeau de coupe sont alignés les uns avec les autres. Retailler la base des pétioles (environ 1 mm) et de transférer immédiatement les feuilles dans l&#39;un des tubes de réaction avec la solution de 20 mM de K-EDTA 2. Les feuilles correspondent plus facile si elles sont légèrement retroussées. Éviter de serrer les feuilles en ce qui risque de causer des blessures des cellules et, par conséquent, conduit à la collecte du contenu des cellules de la feuille. </li><li> Si plus de matériel est nécessaire, couvrir soigneusement les échantillons avec une serviette en papier humide. Utilisez une nouvelle série de plats si pour la collecte des échantillons de différents traitements ou des génotypes. </li><li> Une fois que tous les échantillons sont placés dans des tubes de réaction, de recueillir les exsudats soit dans l&#39;obscurité ou à la lumière. </li><li> Pour la collecte dans l&#39;obscurité, la ligne-de-chaussée d&#39;un grand plat peu profond avec des serviettes en papier humide. Placer la grille avec les tubes de réaction feuilles remplies dans le plat et couvrir soit avec du papier absorbant humide ou le mettre dans un dos en plastique noir avec des fentes pour l&#39;aération. Placez l&#39;ensemble du montage dans une armoire ou une pièce sombre. </li><li> Pour la collecte, à la lumière, tapisser le fond d&#39;un récipient en plexiglas transparent avec des serviettes en papier humide. Placer la grille avec les tubes de réaction remplis de feuilles dans le bac et fermez-le. </li><li> Après 1 heure, enlever les feuilles doucement à partir du conteneur et des tubes de réaction et laver abondamment avec de l&#39;eau distillée, déminéralisée ou Millipore pour enlever toute EDTA. Cette étape sert trois objectifs: (1) il élimine le EDTA à minimiser les dommages aux cellules, (2) il élimine l&#39;interférence de l&#39;EDTA avec SDS-PAGE et la chromatographie, et (3) supprime tous les composés qui se sont accumulés depuis cut / endommagé cellules. Transférer immédiatement dans les tubes de réaction préparés contenant de l&#39;eau autoclave et revenir aux conteneurs de collecte humidifiés pour la collecte des exsudats. À ce stade, ajouter inhibiteur de RNase si l&#39;exsudat doit être utilisé pour l&#39;extraction d&#39;ARN. En option: inhibiteur de protéinase peut être ajouté si l&#39;analyse des protéines est souhaitée. </li><li> Après le temps de collecte destiné, sortez et DISCAe les feuilles et geler les exsudats de phloème dans N2 liquide pour une utilisation ultérieure. Si un stockage prolongé est nécessaire, lyophiliser les échantillons et les conserver à -80 ° C. </li><li> Dans le cas d&#39;Arabidopsis, métabolites peuvent déjà être détectés après la collecte des exsudats pendant 1 heure. Toutefois, la collecte de 5-8 heures est conseillé si l&#39;analyse des composants moins abondantes sont prévues. Pour les grandes installations, comme Perilla, les délais de recouvrement plus longs (8 h) sont recommandés. Exsudat recueilli à partir de 15 feuilles est généralement suffisant pour une voie sur un gel SDS-PAGE (protéines), pour l&#39;extraction de l&#39;ARNm, GC-MS (sucres et de métabolites). Pour l&#39;analyse des lipides la mise en commun de 2-3 échantillons (exsudat de 30 à 45 feuilles) est recommandée et conduit à des résultats plus clairs. </li></ol> 4. Une analyse ultérieure (pour la vidéo Nous n&#39;indiquons que les 4.4) <ol><li> Pour l&#39;analyse des protéines, échantillon remettre en suspension dans 15 pi d&#39;eau et de tampon Lämmli 30 ul, de la chaleur à 95 ° C pendant 5 min, rapidement Isoler tout precipitates et charger ensemble de l&#39;échantillon sur un gel SDS-PAGE (45 poches de chargement pi). Les échantillons doivent être colorées avec Coomassie colloïdal ou d&#39;autres taches sensibles depuis abondance de protéines est très faible. </li><li> Pour le sucre et les petits analyse des métabolites, ajouter des agents de dérivation de l&#39;échantillon séché comme décrit dans la littérature 14. </li><li> ARNm peut être analysée par RT-PCR, puces à ADN ou l&#39;analyse d&#39;ARN-Seq. </li><li> Pour l&#39;analyse des lipides piscine immédiatement deux à trois échantillons et cloisons contre chloroforme: methanol (1:1) dans la hotte comme suit: ajouter une quantité égale de chloroforme et de methanol à chaque échantillon, vortex pendant quelques secondes, et centrifuger pendant 4 min à 400 x g. Recueillir la phase inférieure (organique) dans un tube en verre avec bouchon en téflon et la partition de répétition de la phase supérieure de plus de trois fois. Sécher les phases organiques réunies sous un courant de N 2 et de soumettre à une analyse (chromatographie sur couche mince: TLC 14, 37; liquide spectrométrie de masse à: LC-MS 14). </li></ol>

Nous n&#39;avons rien à révéler.

La collection EDTA facilité de phloème exsudats est très simple, nécessite un équipement minimal, et est applicable à la plupart des plantes. Dans l&#39;ensemble, cette méthode étend la capacité d&#39;analyser les exsudats phloème de plusieurs espèces. Bien que l&#39;exsudat est dilué, il est facile de recueillir de nombreux échantillons différents ou de plusieurs usines à l&#39;échelle jusqu&#39;à une grande quantité de matériel. Ceci permet alors de détecter de nouveaux composés qui sont en très faible abondance et qui seraient autrement ignorés. Cette méthode peut être utilisée pour de multiples espèces végétales et fonctionne comme décrit pour ceux qui sont mentionnés dans ce manuscrit. Si de nouvelles espèces sont explorées, les deux aspects qui pourraient avoir besoin de modification sont le nombre de feuilles utilisées et le temps de l&#39;exsudation. Dans la plupart des cas, une exsudation de cinq à huit heures doit être adapté. Pour confirmer l&#39;utilisation de cette méthode pour de nouvelles espèces de plantes, l&#39;exsudat doit être collecté et un ou plusieurs de l&#39;analyse ultérieure, comme décrit dans le protocole partie 4 needs à effectuer. Selon l&#39;intensité du signal observé, le volume de collecte peut avoir besoin d&#39;être élargis. En général, les lipides et l&#39;analyse des protéines auront besoin de plus de matériel que l&#39;analyse des sucres et du métabolite depuis les premiers sont moins abondants dans les exsudats phloème. Parce que la collecte de l&#39;exsudat EDTA facilité implique surfaces coupées ainsi que d&#39;un effet potentiellement néfaste de l&#39;EDTA, plusieurs points doivent être pris en compte: (1) après une heure d&#39;incubation avec de l&#39;EDTA, les pétioles doivent être soigneusement lavés. Cela supprime tous les composés obtenus à partir de cellules blessés ainsi que l&#39;EDTA lui-même, ce qui pourrait endommager les cellules ou interférer avec l&#39;extraction. (2) Les contrôles positifs et négatifs doivent être inclus pour s&#39;assurer que les données obtenues proviennent de sève et non à partir de cellules lésées (voir les étapes critiques ci-dessous). (3) sève contient plusieurs enzymes, ce qui pourrait être actif lors de la collecte exsudat. Ainsi, dans certains cas, il peut être utile de recueillir des for différentes quantités de temps. (4) Comme le procédé impliqué exsudation dans l&#39;eau, une quantification absolue des composés n&#39;est pas possible. Les étapes critiques: La clé de la bonne utilisation de cette méthode est l&#39;utilisation de prudence lors de la manipulation de l&#39;échantillon pour ne pas blesser les cellules ainsi que l&#39;utilisation de contrôles appropriés (voir ref 14).. Un contrôle approprié est la collecte des exsudats phloème sans traitement préalable avec EDTA. Dans ce cas, le phloème va se sceller et aucun exsudat peut être collectée. Toutes les composés contaminants provenant des cellules blessés seront détectés ici. Un deuxième contrôle serait l&#39;analyse des sucres dans l&#39;exsudat. Dans Arabidopsis, le saccharose doit être le métabolite prédominant au sein de la sève élaborée, avec du fructose à rapport de saccharose de 01 heures 04-à-01:08 (réf. 8, 14). Pour l&#39;extraction d&#39;ARN de l&#39;utilisation d&#39;un inhibiteur de la RNase est nécessaire. En outre, un contrôle positif précédemment décritesed ARNm phloème localisée (UBC9: ubiquitine enzyme de conjugaison 9, At4g27960, 8, 14) et un contrôle négatif par exemple d&#39;un de l&#39;ARNm du chloroplaste (Rubisco LSU) sont souhaitables. Parce que l&#39;exsudat contient des enzymes actives, une évolution dans le temps est conseillé de s&#39;assurer que les changements dans le profil du phloème sont pas simplement due à des variations dans le temps de collecte. Dans certains cas, il peut être avantageux d&#39;utiliser des inhibiteurs de protéases. Toutefois, les enquêteurs doivent garder à l&#39;esprit que l&#39;exsudat recueilli sera concentrée et que les composés ajoutés seront largement concentrées. Une deuxième étape critique dans le protocole est le redécoupage du pétiole sous EDTA. Cette étape sert un double objectif: d&#39;abord, elle supprime tous les plateaux perforés scellés tout en empêchant la formation de nouveaux bouchons permettant ainsi la libre circulation de la sève. Deuxièmement, il supprime la bulle de cavitation dans le xylème généré pendant la coupe et donc permet le transport du xylème. La taille de la deuxième coupe dépends sur les plantes utilisées. Dans les installations avec de grandes pétioles, il devrait être de plusieurs millimètres (jusqu&#39;à 1 cm) au-dessus de la première coupe, dans les plantes comme Arabidopsis, 1-2 mm sont suffisants. L&#39;utilisation de cette méthode peut conduire à la découverte de nouveaux composés dans les exsudats phloème qui auraient signalisation, les implications du développement ou biomédicale. Il a suscité un regard plus en profondeur sur la signalisation des lipides à longue distance, ce qui était un domaine peu étudié dans les sciences végétales en raison du manque d&#39;accès à l&#39;phloème.

Les plantes ne peuvent pas se déplacer pour échapper à des conditions défavorables. Par conséquent, ils ont dû développer des mécanismes pour détecter les stress environnementaux, obtenir et transmettre un signal lié à toute la plante, et d&#39;ajuster en conséquence le développement. Deux systèmes de transport existent pour la distribution d&#39;eau, de nutriments et d&#39;autres composés (signalisation). Le premier est le xylème, qui transporte habituellement de l&#39;eau et des minéraux absorbés par les racines de l&#39;usine. Le second est le phloème. La vue sur le phloème a changé à partir d&#39;un simple système de transport assimiler à un conduit pour l&#39;ARN, les protéines, les virus, les lipides et d&#39;autres petites molécules. Il joue un rôle important dans l&#39;assimiler et le transport des nutriments, la réponse au stress biotique et abiotique, ainsi que dans la croissance et le développement des plantes. Il est désormais appelé le «autoroutes de l&#39;information» de la plante 18. Le phloème est composé de plusieurs types de cellules: parenchyme du phloème, ainsi que compagnon spécialisé CELLS et des éléments tamis. L&#39;élément de tamis est le site de mouvement longue distance. Pour permettre l&#39;écoulement longitudinal dégagée, éléments tamis sont absents la plupart des organites ainsi que les noyaux et sont pensés pour contenir au mieux une machinerie traductionnelle limitée 21, 33. On croit que les cellules compagnes synthétiser des protéines et d&#39;autres composés, qui se déplacent dans le flux phloème. Ces composés sont ensuite transportés dans l&#39;élément de tamis par l&#39;intermédiaire d&#39;plasmodesmata et peuvent fonctionner en tant que signal d&#39;appel interurbain 4,16. Plusieurs groupes de composés peuvent être trouvés dans les exsudats phloème: <ul><li> Les sucres sont souvent les produits de la photosynthèse et sont transportés comme des molécules &quot;énergie-transport&quot; vers d&#39;autres parties de la plante pour le stockage ou comme blocs de construction. Toutefois, ils peuvent également fonctionner comme antigel ou de signalisation des composés. </li><li> Les protéines peuvent également être trouvés dans les exsudats phloème. Ils comprennent des enzymes métaboliques, mais aussi fonction ont de signalisation. Un example d&#39;une protéine qui sert de signal de développement est le locus T protéine de floraison, qui signale l&#39;induction de la floraison, ainsi que l&#39;abscission des feuilles des plantes saisonnière à 6. </li><li> Les acides nucléiques sont présents dans les exsudats phloème sous la forme d&#39;ARNm, les petites et les micro ARN et ARN viraux. Ils semblent être largement impliquées dans la signalisation 27, 28, 39. Dans le même temps, ARNr et ARNt pour presque tous les acides aminés ont été observés dans la sève des cucurbitacées 42. Ils apparaissent à transférer sélectivement dans le système de tube tamis. Les ARNt montrent modifications nécessaires à la possibilité de transférer des acides aminés à l&#39;appareil translationnelle. Pourtant, plutôt que de participer à la traduction, ils semblent inhiber ce processus. Alternativement, ils pourraient servir de source de cytokine ou signaler l&#39;état métabolique de la plante 42. </li><li> Acides gras, oxylipines, et d&#39;autres lipides ont également été trouvés dans le phloème exsudats 3, 13, 14, 23. Jasmoacide nic, un oxylipines se déplace à travers le phloème dans le cadre de la réponse à l&#39;infection pathogène 22, 29, 31, 32. Bien que le rôle de la plupart des lipides du phloème n&#39;est pas encore clair, certains d&#39;entre eux ont probablement fonction de signalisation 4. </li></ul> Le défi de travailler avec le phloème de la plante réside dans sa capacité à se sceller sur blessure. Il existe quatre grandes méthodes utilisées pour recueillir les exsudats phloème, mais ils ne fonctionnent que dans certaines espèces: 1) Dans les cucurbitacées, il est possible d&#39;obtenir des quantités raisonnables de phloème exsudat par des coupures du pétiole. Une fois que la baisse initiale de la contamination de cellules lésées est supprimé, il est possible d&#39;obtenir assez grandes quantités de pur sève 1, 15. Cependant, avec l&#39;augmentation du temps de collecte, ce exsudat s&#39;épaissit, ce qui rend de plus en plus inadapté aux approches de chromatographie liquide (non publié). Des publications récentes suggèrent que selon les espèces, cette sève est dérivé de either la fasciculée (FP) ou le extrafasciculaire phloème (EP) et que, s&#39;il contient &quot;mobile&quot; sève élaborée à partir des éléments tamis (FP), il est aussi sujette à la contamination par d&#39;autres types de cellules, y compris le xylème 40, 41 . 2) Une deuxième approche consiste à obtenir sève élaborée par des coupures peu profondes ou des perforations dans la tige ou pétiole. Cette méthode a été utilisée avec succès dans lupin 17, 25, 36 cucurbitacées, et Brassica napus 12. Ici, la contamination de cellules lésées est minime et les exsudats très pure. Cependant, les plantes ont besoin pour être en bonne santé et bien arrosée, car il est très difficile de percer sélectivement seulement les éléments de tamis. Si vaisseaux du bois sont entaillés, tout exsudat est aspiré dans le flux de xylème. Cela rend la méthode inadaptée pour les plantes à tiges ou les pétioles très fragiles et très lignifiées. 3) stylectomy de puceron pucerons permet d&#39;insérer leur stylet dans les tubes criblés dun enlevant le puceron avec un laser. Sève est sécrétée par le reste stylet 2, 9, 10, 35, 38. En théorie, toute plante qui peut être infecté par des pucerons peut être utilisé pour cette approche. Cependant, la plupart de serre ou managers en chambre de croissance ne seront pas en charge l&#39;utilisation d&#39;un agent pathogène. En outre, les pucerons introduisent plusieurs protéines dans le phloème avec leur salive 19, 33. Cela conduit à une reprogrammation 30 transcriptionnelle limitée et a le potentiel de changer la composition du phloème 26. 4) La méthode décrite ici est l&#39;exsudation EDTA facilité de sève. Cette méthode utilise l&#39;EDTA pour prévenir étanchéité du phloème 20. EDTA chélate ions Ca 2 + qui participeraient autrement dans les processus qui scellent le phloème. Alors que l&#39;EDTA peut conduire à des dommages cellulaires 30, plusieurs groupes ont utilisé cette méthode et observé aucun effet indésirable des concentrations d&#39;EDTA de 10 à 20 mm sur l&#39;ultrastructure cellulaire ou sur phloem chargement et le transport 5, 24. Pour réduire les effets dommageables ainsi que l&#39;interférence de l&#39;EDTA par chromatographie et électrophorèse sur gel, les plantes sont déplacés dans l&#39;eau après 1 h et uniquement la partie postérieure de l&#39;exsudat est utilisé 14. Ainsi, plutôt que exsudation dans de l&#39;EDTA, du phloème est exudated dans l&#39;eau (exsudation EDTA-animé). C&#39;est une méthode straight-forward, à faible coût et de faible technicité pour la collecte des exsudats phloème. Sève obtenu de cette manière peut être utilisée pour analyser les protéines, petites molécules, des lipides et des ARN et a été utilisé avec succès dans de nombreuses plantes. Malgré le nombre limité d&#39;expériences a été effectuée chez les monocotylédones 11, la méthode semble être plus approprié pour les dicotylédones (Perilla 17, 20, Arabidopsis 8, 13, 14, Poplar 7). Collection d&#39;exsudats doit se produire dans un environnement humide pour éviter les pertes d&#39;exsudats par la transpiration. En fonction de la plante, l&#39;incubation dans de l&#39;EDTA pour une à deux heures estsuffisante pour empêcher l&#39;étanchéité des éléments du phloème / tamis. La collection peut alors se produire dans l&#39;eau. Ceci a l&#39;avantage d&#39;éviter l&#39;effet négatif EDTA a sur la structure et la stabilité cellule. Il élimine aussi les interférences de l&#39;EDTA avec des méthodes telles que HPLC ou SDS-PAGE. Il est représenté tel qu&#39;il s&#39;applique aux Arabidopsis. Pour les grandes installations, l&#39;incubation dans de l&#39;EDTA et l&#39;exsudat collections doit être intensifié et est effectuée dans des béchers plutôt que dans 1,7 tubes de réaction ml.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="638">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">K2-EDTA</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">ED2P-500G</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:153px;">Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15 cm)</td>
			<td>PYREX or Corning</td>
			<td></td>
			<td>Any clean, shallow dish will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>EMD</td>
			<td>CX1054-1</td>
			<td style="width:223px;">Only open containers in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td style="width:152px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:111px;">9070-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Screw cap tubes</td>
			<td style="width:152px;">VWR International</td>
			<td style="width:111px;">53283-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Screw cap tubes</td>
			<td style="width:152px;">Sun Sri</td>
			<td style="width:111px;">13-425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:152px;">Denville</td>
			<td style="width:111px;">C2170</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection and analysis of arabidopsis phloem exudates using the edta-facilitated method

Le phloème des plantes est essentiel pour le transport à longue distance de (photo) assimile ainsi que la transmission des signaux de stress biotique ou abiotique. Il contient des sucres, des acides aminés, des protéines, des lipides, de l&#39;ARN et d&#39;autres métabolites. Bien qu&#39;il existe un grand intérêt pour la compréhension de la composition et le fonctionnement du phloème, le rôle d&#39;un grand nombre de ces molécules et donc leur importance dans le développement de la plante et la réponse au stress doit encore être déterminée. Un obstacle à l&#39;analyse phloème réside dans le fait que les phoques du phloème lui-même lors d&#39;une lésion. En conséquence, le nombre de plantes à partir desquelles sève peut être obtenue est limitée. Une méthode qui permet la collecte des exsudats phloème de plusieurs espèces de plantes, sans équipement supplémentaire est la collection EDTA facilitée par le phloème exsudat décrite ici. Bien qu&#39;il soit facile à utiliser, elle conduit à la blessure de cellules et de soins doit être prise pour enlever le contenu des cellules endommagées. En outre, plusieurs témoins pour prouver la pureté de l&#39;exsudatsont nécessaires. Parce que c&#39;est une exsudation plutôt qu&#39;une collecte directe de la sève élaborée (pas possible dans de nombreuses espèces) seulement quantification relative de son contenu peut se produire. L&#39;avantage de cette méthode sur les autres est qu&#39;il peut être utilisé dans de nombreuses espèces herbacées ou ligneuses (Perilla, Arabidopsis, peuplier, etc) et nécessite un équipement et une formation minimale. Elle conduit à relativement grandes quantités d&#39;exsudats qui peuvent être utilisées pour une analyse ultérieure des protéines, des sucres, des lipides, des ARN, des virus et des métabolites. Il est assez simple qu&#39;il peut être utilisé à la fois une recherche, ainsi que dans un laboratoire d&#39;enseignement.

Il est devenu évident au cours des dernières années que la complexité de la sève peut être la réponse à la question de savoir comment les plantes envoient différents signaux de développement et de stress pour une réponse optimale. En utilisant l&#39;EDTA facilité exsudation phloème peut fournir l&#39;occasion d&#39;analyser les exsudats phloème de plantes qui ne conviennent pas à d&#39;autres approches, mais peut-être un intérêt économique ou physiologique. Cette méthode permet la récolte de suffisamment phloème exsudats pour identifier les protéines phloème localisés et détecter des changements dans leur niveau en réponse au développement ou de stress (figure 3). Comme le montre la figure, les protéines sont en très faible abondance, et pourtant, leur niveau est suffisamment élevé pour des expériences de protéomique ultérieures par LC-MS/MS ou pour l&#39;analyse de Western blot. Les conclusions de cucurbitacées suggèrent que la coupe de la tige entraîne une perturbation de l&#39;équilibre du potentiel de l&#39;eau et un afflux ultérieur de l&#39;eau etcontaminants possibles du apoplaste 41. Pourtant, la collecte des temps allant de un à huit heures n&#39;affecte pas le profil du phloème de protéines / composition chez Arabidopsis (. Seulement la quantité absolue varie Guelette et al), la quantité de protéines recueillies et le modèle de protéines trouvées varie selon les espèces (Arabidopsis: Au; Perilla, voie I et NI) et les traitements (Perilla cultivé à différentes longueurs de jour, voie I et NI). En tant que signaux protéiques de résultats peuvent être visualisés, identifiés et suivis. ARNm et micro ARNs peuvent également être identifiés dans les exsudats phloème par cette méthode. Cependant, le traitement avec un inhibiteur de la RNase est nécessaire pour éviter la dégradation de l&#39;ARNm pendant le temps d&#39;exsudation prolongée. Comme les éléments tamis ne contiennent pas de chloroplastes fonctionnels, Rubisco petite ou grande sous-unité (hématies ou RbcL, respectivement) ARNm peuvent être utilisés comme témoins négatifs, tandis connu phloème-ARNm localisée comme enzyme de conjugaison de l&#39;ubiquitine peut être utilisé comme un témoin positif (figure 4). De même, les sucres ou les petits métabolites peuvent être analysés en utilisant soit GC-MS ou LC-MS. Ici, il convient de mentionner que les exsudats de phloème contiennent un grand nombre d&#39;enzymes fonctionnelles, y compris la quasi-totalité glycolyse 12. Ainsi, en utilisant plusieurs points dans le temps peut révéler les processus métaboliques lors de la collecte exsudat. Un exemple est illustré à la figure 5: Dans tous les exsudats, le saccharose est le métabolite le plus abondant, ce qui est le plus évident après une collection pendant 1 heure. Toutefois, après cinq heures du saccharose rapport fructose est légèrement réduite. Si le même exsudat est collecté pendant une heure et laissé sur le banc pour les quatre prochaines heures, le saccharose et de fructose ratio est réduit à une mesure beaucoup plus importante, ce qui suggère que les enzymes actives dans le phloème exsudats conduire à une dégradation du saccharose à température ambiantetempérature (pour plus d&#39;interprétations de pointe voir 14). Ceci est cohérent avec les résultats que phloème chargement et le transport des molécules à partir de cellules compagnes dans les éléments de tamis peuvent continuer pendant exsudation jusqu&#39;à ce que le système perd de sa vitalité 34. Lipides dans les exsudats phloème et, par extension, de la signalisation des lipides à longue distance sont un domaine relativement récent de l&#39;intérêt pour la science des plantes. En raison de leur nature hydrophobe des lipides ne sont présents en faibles concentrations et peuvent être liés à d&#39;autres molécules de solubilisation. Pourtant, l&#39;exsudation EDTA facilité permet la collecte de suffisamment de matière pour visualiser (TLC; Figure 6) et d&#39;identifier (LC-MS; Figure 7) lipides phloème de plusieurs espèces de plantes. Comme la figure montre qu&#39;il est possible d&#39;identifier et de séparer plusieurs espèces de lipides. LC-MS permet d&#39;identifier les différentes espèces de lipides et de suivre les changements dans les profils lipidiques des différegénotypes NT ou traitements. Cela permet pour l&#39;étude du rôle des lipides au cours du développement de la plante et la réponse au stress. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig1.jpg" width="600px" /> Figure 1. Organigramme de la collection du phloème exsudats d&#39;Arabidopsis ou Perilla. Différents chemins mènent à différents produits finis, qui sont indiqués en bleu. Pour la préparation de l&#39;ARN, un inhibiteur de RNase (100 U / ml, Roche) est ajouté à l&#39;eau dans laquelle l&#39;exsudat phloème est recueilli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig2.jpg" width="600px" /> Figure 2. Installation de matériaux pour le phloème exsudat recueillird&#39;ions. Le setup affiche tous les matériaux nécessaires pour le protocole étapes 3.1-3.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig3.jpg" width="600px" /> . Figure 3 protéines trouvées dans le phloème exsudats de deux espèces différentes de plantes, Arabidopsis (AT) et Perilla (I et NI; différentes longueurs de jour); MW: marqueurs de poids moléculaire (piste 2). Les protéines ont été séparées à l&#39;aide d&#39;un gradient de 10 à 20% SDS-PAGE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig4.jpg" width="600px" /> Figure 4. Analysede la présence d&#39;ARNm de la Rubisco petite et grande sous-unité (hématies et RbcL, respectivement) et de l&#39;enzyme de conjugaison de l&#39;ubiquitine (UCB). L&#39;ARNm a été recueilli à partir des feuilles d&#39;Arabidopsis (L), les pétioles (P), et les exsudats du phloème (Ph), inverser les transcriptions transcrits et spécifique visualisés à l&#39;aide de PCR. Le chiffre a été modifié à partir de Guelette et al. 14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig4highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig5.jpg" width="600px" /> Figure GC-MS profil de phloème 5. Exsudats recueillis montant différent de fois. On notera que la quantité relative des changements de saccharose de 1 heure de collecte (A) à 5 heures de temps de collecte (B). Exsudat profil après la collecte pendant 1 heure suivie de «incubation» à la salle<html> température (RT) pendant quatre heures, (C). profil des métabolites de la feuille (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig5highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig6.jpg" width="600px" /> Figure 6. Couche mince chromatogramme comparant les lipides de Perilla (à gauche) et les feuilles d&#39;Arabidopsis (à droite) et les exsudats de phloème. Les astérisques indiquent les lipides spécifiques pour exsudats phloème. DGDG: digalactosyldiacylglycérol; PG: phosphatidylglycerol; MGDG: monogalactosyldiacyglycerol, la partie de la figure montrant lipides Arabidopsis a été modifié depuis Guelette et al. 14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig6highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figure 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig7.jpg" width="600px" /> Figure 7. Du profil lipidique du phloème exsudats d&#39;Arabidopsis (chloroforme phases) à l&#39;aide de LC-MS / mode d&#39;ions négatifs. Graphiques dans le top (mutant, A) et le fond (de type sauvage, B) montrent les différences dans les profils lipidiques entre les deux génotypes différents (indiqués par des flèches). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig7highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> .

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Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

La connaissance de la composition de la sève ainsi que le mécanisme de son transport de chargement et de longue distance est essentielle pour la compréhension de la signalisation à longue distance dans le développement de la plante et le stress / réponse pathogène et de les assimiler transport. Ce manuscrit décrit la collecte des exsudats phloème en utilisant la méthode EDTA-animé.

Collecte et analyse des<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Phloème exsudats Utilisation de la méthode EDTA-animé

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

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Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Complexometric Titration, Precipitation Titration, and Gravimetry

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24.2K vues.  Michigan State Universtiy.  La connaissance de la composition de la sève ainsi que le mécanisme de son transport de chargement et de longue distance est essentielle pour la compréhension de la signalisation à longue distance dans le développement de la plante et le stress / réponse pathogène et de les assimiler transport. Ce manuscrit décrit la collecte des exsudats phloème en utilisant la méthode EDTA-animé. 

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A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

Une méthode simple pour l&#39;imagerie Arabidopsis Feuilles utilisant perfluorodécaline comme un moyen d&#39;imagerie infiltratives

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Recherche

Biologie

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Analyse cellulaire spécifique de<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Feuilles en utilisant la fluorescence par tri cellulaire activé

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

Une méthode efficace pour quantitative, analyse unicellulaire de la chromatine Modification et architecture nucléaire dans l&#39;ensemble du montage ovules dans<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Détection et analyse de l&#39;ADN dommages souris muscle squelettique<em&gt; In Situ</em&gt; Utilisation de la méthode TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of microbial contaminants present on the seed surface. Currently, Arabidopsis seeds are sterilized using two distinct sterilization techniques in conditions that differ slightly between labs and have not been standardized, often resulting in only partially effective sterilization or in excessive seed mortality. Most of these methods are also not easily scalable to a large number of seed lines of diverse genotypes. As technologies for high-throughput analysis of Arabidopsis continue to proliferate, standardized techniques for sterilizing large numbers of seeds of different genotypes are becoming essential for conducting these types of experiments. The response of a number of Arabidopsis lines to two different sterilization techniques was evaluated based on seed germination rate and the level of seed contamination with microbes and other pathogens. The treatments included different concentrations of sterilizing agents and times of exposure, combined to determine optimal conditions for Arabidopsis seed sterilization. Optimized protocols have been developed for two different sterilization methods: bleach (liquid-phase) and chlorine (Cl2) gas (vapor-phase), both resulting in high seed germination rates and minimal microbial contamination. The utility of these protocols was illustrated through the testing of both wild type and mutant seeds with a range of germination potentials. Our results show that seeds can be effectively sterilized using either method without excessive seed mortality, although detrimental effects of sterilization were observed for seeds with lower than optimal germination potential. In addition, an equation was developed to enable researchers to apply the standardized chlorine gas sterilization conditions to airtight containers of different sizes. The protocols described here allow easy, efficient, and inexpensive seed sterilization for a large number of Arabidopsis lines.

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

Méthode normalisée pour la stérilisation à haut débit des graines d’Arabidopsis

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

Une méthode polyvalente pour le montage de Arabidopsis quitte pour l’imagerie Intravitale time-lapse

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective transmission among host rice. Laodelphax striatellus (small brown planthopper, SBPH) is the primary insect vector that horizontally transmits RSV while sucking sap from the phloem. Saliva plays a significant role in insects' feeding behavior. A convenient method that will be useful for research on insects' saliva with piercing-sucking feeding behavior is described here. In this method, insects were allowed to feed on an artificial diet sandwiched between two stretched paraffin film layers. The diet containing the saliva was collected each day, filtered, and concentrated for further analysis. Finally, the quality of collected saliva was examined by protein staining and immunoblotting. This method was exemplified by detecting the presence of RSV and a mucin-like protein in the saliva of SBPH. These artificial feeding and saliva collection method will lay a foundation for further research on factors in insect saliva related to feeding behavior and virus transmission.

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

The present protocol describes a method to collect sufficient saliva from piercing-sucking insects using an artificial medium. This is a convenient method for collecting insect saliva and studying salivary function on insect feeding behavior and vector-borne virus transmission.

Méthode sandwich à membrane à deux couches pour la collection de salive Laodelphax striatellus

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective ...

High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental step required towards this end. Thus, it is paramount to establish high-throughput Arabidopsis seed surface sterilization methods to handle tens to hundreds of samples (e.g., transgenic lines, ecotypes, or mutants) at once. A seed surface sterilization method based on the efficient elimination of liquid in tubes with a homemade suction device constructed from a common vacuum pump is presented in this study. By dramatically reducing labor-intensive hands-on time with this method handling several hundreds of samples in one day is possible with little effort. Series time-course analyses further indicated a highly flexible time range of surface sterilization by maintaining high germination rates. This method could be easily adapted for surface sterilization of other kinds of small seeds with simple customization of the suction device according to the seed size, and the speed desired to eliminate the liquid.

A high-throughput protocol for the surface sterilization of Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) seeds is provided, optimizing the liquid handling steps with a simple suction device constructed with a vacuum pump. Hundreds of seed samples can be surface-sterilized in one day.

Méthode à haut débit, robuste et très flexible dans le temps pour la stérilisation de surface des graines d’Arabidopsis

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward method to quickly identify the chemoattractants that could induce the chemotactic movement of rhizosphere growth-promoting bacteria on sterile glass slides via simple steps. Bacteria solution (OD600 = 0.5) and sterile chemoattractant aqueous solution were added dropwise on the glass slide at an interval of 1 cm. An inoculating loop was used to connect the chemoattractant aqueous solution to the bacterial solution. The slide was kept at room temperature for 20 min on the clean bench. Finally, the chemoattractant aqueous solution was collected for bacterial counting and microscopic observation. In this study, through multiple comparisons of experimental results, the method overcame multiple shortcomings of traditional bacterial chemotaxis methods. The method reduced the error of plate counting and shortened the experimental cycle. For the identification of chemoattractant substances, this new method can save 2-3 days compared to the traditional method. Additionally, this method allows any researcher to systematically complete a bacterial chemotaxis experiment within 1-2 days. The protocol can be considered a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Here, we present an improved chemotaxis assay protocol. The goal of this protocol is to reduce the steps and costs of traditional bacterial chemotaxis methods and to serve as a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Un test de chimiotaxie amélioré pour l’identification rapide des chimioattractifs rhizobactériens dans les exsudats racinaires

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...

Live Imaging of Arabidopsis Pollen Tube Reception and Double Fertilization Using the Semi-In Vitro Cum Septum Method

In flowering plants, the growth and guidance of the pollen tube (male gametophyte) within the pistil and the reception of the pollen tube by the female gametophyte are essential for double fertilization and subsequent seed development. The interactions between male and female gametophytes during pollen tube reception culminate in pollen tube rupture and the release of two sperm cells to effect double fertilization. As pollen tube growth and double fertilization are deeply hidden within the tissues of the flower, this process is difficult to observe in vivo.
A semi-in vitro (SIV) method for the live-cell imaging of fertilization in the model plant Arabidopsis thaliana has been developed and implemented in several investigations. These studies have helped to elucidate the fundamental features of how the fertilization process occurs in flowering plants and which cellular and molecular changes occur during the interaction of the male and female gametophytes. However, because these live cell imaging experiments involve the excision of individual ovules, they are limited to a low number of observations per imaging session, making this approach tedious and very time-consuming. Among other technical difficulties, a failure of the pollen tubes to fertilize the ovules in vitro is&#160;often reported, which severely confounds such analyses.
Here, a detailed video protocol for the imaging of pollen tube reception and fertilization in an automated and high-throughput manner is provided, allowing for up to 40 observations of pollen tube reception and rupture per imaging session. Coupled with the use of genetically encoded biosensors and marker lines, this method enables the generation of large sample sizes with a reduced time investment. Nuances and critical points of the technique, including flower staging, dissection, medium preparation, and imaging, are clearly detailed in video format to facilitate future research on the dynamics of pollen tube guidance, reception, and double fertilization.

Live Imaging of Arabidopsis Pollen Tube Reception and Double Fertilization Using the Semi-In Vitro Cum Septum Method

Here, we describe an improvement of the semi-in vitro (SIV) method for observing pollen tube guidance and reception in Arabidopsis thaliana,&#160;which increases the receptivity of ovules. The high-throughput SIV cum septum method may be coupled with gametophyte marker lines and genetically encoded biosensors to monitor the dynamic process of fertilization.

Imagerie en direct de la réception du tube pollinique d’Arabidopsis et de la double fécondation à l’aide de la méthode semi-in vitro cum septum

In flowering plants, the growth and guidance of the pollen tube (male gametophyte) within the pistil and the reception of the pollen tube by the female ...