L’isolement de plastoglobules très purs est essentiel à leur étude. Un protocole rapide et efficace pour leur isolement qui facilite leur étude biochimique en aval est présenté ici. Le principal avantage de cette méthode est la rapidité relative de la procédure et son adaptabilité à de nombreuses espèces végétales et conditions environnementales.
Des précautions particulières doivent être prises lors de la sonication des resuspensions de thylakoïdes pour assurer une force suffisante pour enlever les plastoglobules des thylakoïdes et avec l’extraction ultérieure des plastoglobules du gradient de saccharose. Le Dr Elsinraju Devadasu, chercheur postdoctoral dans mon laboratoire, et Febri Susanto, doctorant dans mon laboratoire, feront la démonstration de cette procédure. Commencez par acquérir des plants de six maïs sains, âgés de trois semaines, ayant un stade de croissance V5 et pesant environ 120 grammes.
Coupez toutes les feuilles à la base de la tige et plongez-les rapidement dans un bain de glace avant de les transporter dans la chambre froide. En travaillant sous une lampe de sécurité verte, retirez les feuilles de maïs du bain de glace et coupez-les en petits morceaux de cinq centimètres sur cinq à l’aide de ciseaux. Broyer doucement et soigneusement la moitié du tissu foliaire coupé dans 350 millilitres du tampon de broyage à un niveau inférieur à sept sur un mélangeur commercial.
Démarrez et arrêtez le mélangeur cinq à six fois pour vous assurer que toutes les feuilles sont coupées. Filtrer l’homogénat à travers une couche de tissu en nylon de 25 microns sur un grand entonnoir jusqu’à quatre bouteilles centrifugeuses de 250 millilitres. Après avoir répété l’étape de mélange avec le reste du tissu foliaire coupé, répartir uniformément le filtrat entre les quatre bouteilles.
Retirer une partie aliquote du filtrat foliaire et la mettre de côté pour qu’elle soit conservée en tant qu’échantillon total représentatif de la feuille. Ensuite, centrifugez le filtrat pendant six minutes à 1 840 G et quatre degrés Celsius. Versez le surnageant résultant et, avec de doux mouvements tourbillonnants de la brosse, remettez en suspension la pastille dans 12 millilitres de milieu R 0,2, contenant 0,2 molaire de saccharose.
Après avoir remis en suspension la pastille dans une bouteille, ajoutez la suspension à la bouteille suivante et répétez la remise en suspension pour regrouper les suspensions dans une bouteille. Répartir la suspension groupée entre six tubes ultracentrifuges de trois millilitres, atteignant un volume maximal de 2,5 millilitres dans chaque tube. Utilisez ensuite le sonicateur de pointe à une amplitude de 100% pour sonifier chaque tube quatre fois pendant 10 secondes chacun.
Assurez-vous de garder la corne du sonicateur immergée et éloignée de la surface du liquide pour éviter la mousse. Déplacez lentement la corne du sonicateur de haut en bas dans la suspension pendant chaque tour. Tout en alternant les quatre tubes, remettre chaque tube dans un seau à glace après chaque sonication pour permettre à l’échantillon de refroidir.
Une fois cela fait, centrifuger la suspension de thylakoïdes bruts soniqués à 150 000 G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Écumer la surface du coussin à l’aide d’une seringue et d’une aiguille de calibre 22 et récolter le tampon flottant jaune et huileux résultant de plastoglobules bruts du coussin de saccharose. Récupérez environ 500 microlitres de chaque tube et déposez-les dans un tube de 2,0 millilitres.
Recueillir les aliquotes thylakoïdes brutes avant et après la sonication et la libération de plastoglobules. Une fois cela fait, continuez le traitement des tissus végétaux ou stockez les plastoglobules bruts à moins 80 degrés Celsius et purifiez-les plus tard. Cultiver 50 millilitres de culture de l’espèce PCC 6802 de synechocystis dans un milieu BG11 pendant 7 à 10 jours pour atteindre la phase stationnaire.
À l’aide d’un spectrophotomètre, ajustez la densité cellulaire à une densité optique de 2,0 à 750 nanomètres. Pour éliminer les polysaccharides, centrifuger 50 millilitres de culture et retirer le surnageant. Répétez le lavage des cellules dans 50 millilitres de tampon A deux fois.
Remettez en suspension la pastille lavée dans 25 millilitres de tampon A et brisez les cellules à l’aide d’une cellule de pression française à 1 100 livres de pouces carrés. Répétez le processus trois fois par temps froid jusqu’à ce que la couleur lysée passe du vert au rouge, bleu, vert sous lumière blanche. Retirer la partie aliquote de l’homogénat cellulaire et la mettre de côté pour la conserver en tant qu’échantillon cellulaire total représentatif.
Répartir l’homogénat obtenu dans huit tubes ultracentrifugés de trois millilitres remplis à un maximum de 2,5 millilitres dans chaque tube. Superposez cet homogénat avec 400 microlitres de milieu R, produisant un gradient progressif. Équilibrez soigneusement les tubes en ajoutant un milieu R supplémentaire si nécessaire avant de centrifuger les tubes.
Le thylakoïde et d’autres organites plus lourds, y compris les corps polyhydroxyalcanoates, montrent la formation de granulés, tandis que les plastoglobules forment un tampon huileux jaune sur ou près du sommet du gradient de saccharose. Récoltez la plaquette flottante résultante de plastoglobules bruts avec une seringue, comme démontré précédemment, et déposez la récolte dans un tube de deux millilitres. Grattez les plastoglobules du côté de la paroi du tube ultracentrifuge avec une pointe d’aiguille si nécessaire.
Continuez le traitement des cyanobactéries ou stockez les plastoglobules bruts à moins 80 degrés Celsius et purifiez plus tard. Pour récolter les plastoglobules purs en utilisant la méthode de traitement des tissus végétaux, préparez le gradient de saccharose décrit précédemment en utilisant 500 microlitres de plastoglobules bruts, 400 microlitres de milieu R 0,2 et 400 microlitres de milieu R.Après centrifugation, récoltez le tampon flottant résultant de plastoglobules purs dans un tube de deux millilitres. Après avoir aliquote les plastoglobules purs et congelé les aliquotes dans de l’azote liquide, stockez-les à moins 80 degrés Celsius ou lyophilisez-les en une poudre sèche.
Pour récolter des plastoglobules purs de cyanobactéries, créez un gradient de saccharose, comme mentionné précédemment, en utilisant 500 microlitres de plastoglobules bruts, 750 microlitres de milieu R 0,7 et 750 microlitres de milieu R 0,2. Après centrifugation, recueillir les plastoglobules purs dans un tube de 1,5 millilitre et aliquoter les plastoglobules purs. Une fois cela fait, congelez les aliquotes de plastoglobules purs dans de l’azote liquide et stockez-les directement à moins 80 degrés Celsius ou lyophilisez en une poudre sèche.
Dans cette méthode, une quantité importante de plastoglobule ou de gouttelettes lipidiques a été observée flottant sur la couche supérieure du coussin de saccharose. Après centrifugation ultérieure, des plastoglobules purifiés ont été obtenus à la surface ou près de la surface du gradient de saccharose. Après l’isolement réussi des plastoglobules, les immunoblots développés pour l’évaluation de la pureté en utilisant des anticorps élevés contre arabidopsis thaliana fibrillin 1a et arabidopsis thaliana photosystem II sous-unité D1 ont montré que les homologues de la fibrilline étaient principalement associés aux thylakoïdes que les plastoglobules.
Pour assurer l’extraction efficace et concentrée du tampon flottant, placez l’orifice de l’aiguille de la seringue juste en dessous de la surface liquide du tampon tout en étant complètement immergé, puis tirez doucement vers le haut. Des échantillons isolés de plastoglobules se prêtent à des études protéomiques ou lipidomiques ultérieures et ont été utilisés pour démontrer les changements dans la composition protéine-lipidique ciblée dans différentes conditions environnementales. Cette technique a facilité de nouvelles études sur les plastoglobules, y compris la découverte de l’activité protéique kinase associée et la présence de complexes protéiques oligomères grâce à des études biochimiques ultérieures.
