Nous remercions nos sources de financement de Génome Canada et Génome Québec et Université de Montréal ainsi que le financement de la Fondation canadienne pour l&#39;innovation pour le financement de notre «Synapse à la maladie» (S2D) du projet.

1. Sélection de la maladie qui peut être causée par des mutations de novo Une maladie qui correspond aux critères suivants peuvent tenir à l&#39;hypothèse de mutations de novo: <ol><li> L&#39;aptitude à la reproduction est réduite. </li><li> La fréquence de la maladie est relativement élevée et constante malgré des environnements très variés. </li><li> La maladie est associée à un âge plus élevé paternelle. </li><li> Le lien classique et les études d&#39;association a omis d&#39;expliquer une fraction significative de l&#39;héritabilité de la maladie. </li><li> Les données de concordance jumelles soutenir un modèle de novo. </li></ol> Analyse de la probabilité qu&#39;une maladie commune où des mutations de novo peut expliquer en partie la base génétique est une première étape essentielle. 2. Sélection des cas et des échantillons d&#39;ADN Sélection des échantillons appropriés est essentiel pour la réussite de l&#39;identification de mutations de novo. Pour maximiser les chances de trouver des mutations de novo, nous recommandons ce qui suit: <ol><li> Sélectionnez cas avec l&#39;âge précoce de survenue, le phénotype sévère, avec des parents non, pères plus âgés et sans antécédents de la famille élargie de la maladie. </li><li> Choisissez les patients dont les ADN disponibles sont suffisantes pour mener l&#39;étude. Surtout crucial est la disponibilité de l&#39;ADN provenant d&#39;une source de cellules primaires qui n&#39;a pas été soumis à la culture (ADN par exemple du sang ou d&#39;ADN de salive), </li><li> La disponibilité des deux parents, l&#39;ADN est essentielle afin de déterminer l&#39;état de la transmission de mutation (héritée vs de novo). Disponibilité des cohortes supplémentaires affectés et des témoins normaux est nécessaire pour les études de validation génétique fois les gènes candidats sont identifiés. </li><li> Estimer la taille de l&#39;échantillon sur la base des taux de mutations, la quantité de gènes à être projeté et l&#39;estimation de la fraction des cas qui peuvent résulter d&#39;une mutation de novo. </li></ol> 3. Gene reséquençage; deux grandes approches <ol><li> Séquençage à haute qualité à faible Cette approche est basée sur des gènes candidats les approches. <ol><li> Sélection du gène candidat (s) Sélectionnez les meilleurs gènes candidat basé sur un système de notation qui est construit sur six critères principaux. Calculez ensuite le total qui correspondait à la somme de tous les points attribués à l&#39;aide des six critères énumérés dans le tableau 1. Voir un exemple de notre projet dans la figure 1 de la distribution des gènes sélectionnés et non sélectionnés. <img src="/files/ftp_upload/2534/2534table1.jpg" alt="Tableau 1"/> Tableau 1 Critères. Utilisé pour la sélection de gènes candidats <img src="/files/ftp_upload/2534/2534fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Graphique montrant la répartition des gènes sélectionnés et non sélectionnés pour le séquençage de notre projet. Nous avons obtenu une distribution des gènes classés par propriétés candidat par les gènes de tri en fonction de leur valeur de score. Par exemple, SHANK3 et NRXN1 gènes, deux gènes que nous avons trouvé une mutation de novo, avaient un score de 7 et 6 respectivement (maximum 12). </li><li> Amorces de conception en utilisant le logiciel Primers3 travers Exonprimer. Seule la région codante et jonction d&#39;épissage devraient être couverts, y compris un supplément de 50 paires de base de chaque côté de l&#39;exon. </li><li> Optimiser les conditions de PCR pour le choix de Taq, le volume de réaction, etc </li><li> Optimiser tous les fragments de PCR </li><li> Amplifier 5 ng d&#39;ADN génomique extrait à partir d&#39;échantillons de sang selon des procédures standard </li><li> Avant d&#39;envoyer pour le séquençage, ne contrôle qualité de vos produits de PCR en chargeant un de 2% gel d&#39;agarose. Échantillons choisis au hasard. </li><li> Séquence des produits de PCR sur un analyseur d&#39;ADN sur un brin. Un fragment est considéré comme réussi le séquençage si l&#39;analyse de plus de 90% de la trace est possible. Ceci est applicable pour un criblage à grande échelle. </li><li> Détection Variantes <ol><li> Utiliser des outils pour la détection et le génotypage des variations génomiques telles que PolyPhred, Polyscan et Mutation Surveyor. Une combinaison de plus de 2 outils de détection est idéal. Par exemple, PolyPhred v.5 et PolyPhred v.6 avec les paramètres par défaut ne détectent pas les mêmes variations. V.3 Polyscan a un taux de mutation plus élevé de faux positifs pour le SNP (96%) et moins pour les indels (93%). PolyPhred v.6 n&#39;a pas détecté la majorité des indels vrai, mais ont un taux de mutation faux positifs (pour indels) inférieur Polyscan globale v.3 (90%). Nous devons supprimer l&#39;option de détection de SNPs pour v.3 Polyscan et garder les deux PolyPhred v.5 et PolyPhred v.6 pour la détection des variants. Mutation Surveyor et Polyscan sont meilleurs pour détecter les indels. Remarque: L&#39;option de détection de SNP ne doit pas être appliquée lors de l&#39;utilisation Polyscan. Seul le &quot;Indel&quot; option doit être activée. Polyscan généré de nombreux faux positifs pour la détection de SNP. </li><li> Pour chaque roman de variantes uniques exonique détecté, il confirme manuellement en reamplifying le fragment et resequencing la proposante et les deux parents en utilisant des amorces marche avant et arrière pour éliminer tout artefact technique. </li></ol></li></ol></li><li> Whole exome séquençage Cette approche est un séquençage à haut débit ciblant la majorité des régions codantes du génome humain. Nous sommes maintenant utilisent actuellement cette nouvelle approche dans notre laboratoire, ce qui accélère la détection des gènes candidats potentiels. <ol><li> Commandez &quot;SureSelect homme Tous Exon» ciblant la région codante de plus de 16 000 gènes (50 Mo du génome), conçu par Agilent ou tout autre produit similaire par les autres comme Roche. Avant de commander le kit de capture, les plates-formes de séquençage devrait être de déterminer (Illumina vs solide). </li><li> Ne la capture selon le protocole d&#39;Agilent </li><li> Séquence du produit sur votre respectives disponibles la prochaine génération de plate-forme de </li><li> Variante de détection à partir du séquençage toute exome: Plusieurs outils bioinformatiques pour la détection et le génotypage des variations génomiques de la plate-forme de séquençage nouvelle génération sont disponibles telles que BWA, Bfast, le Bioscope qui effectuera l&#39;alignement. Après quoi supplémentaires librement disponibles des outils aval (par exemple SAM outils, Varscan, Annovar) serait nécessaire, il appeler et d&#39;annoter les variantes. Les logiciels commerciaux qui intègre l&#39;alignement de séquences et d&#39;appeler la variante et l&#39;annotation sont également disponibles tels que, NextGen (Softgenetics), CLC bio, et d&#39;autres </li></ol></li></ol> 4. Genomic hiérarchisation variantes Variantes identifiées sont alors prioritaires pour le suivi en fonction de leur probabilité d&#39;être de novo et délétère pour la fonction des protéines ou de l&#39;ARNm et / ou de la structure. La variante de suivi des priorités pour la détection de novo variante doivent être comme suit: <ol><li> Variations uniques (observée une fois dans un seul cas) </li><li> Variations pas présente chez les parents </li><li> Protéine-tronquant variations: un non-sens, indels menant à frameshift et des mutations d&#39;épissage. </li><li> Variation de faux-sens et silencieux prévu pour être fonctionnellement perturbateurs (par exemple, affectent épissage de l&#39;ARNm). Utilisez Polyphen, EIPD et PANTHER pour un effet de prédiction fonctionnelle de la protéine. </li></ol> Si vous utilisez séquençage exome ensemble, la sélection de gènes candidats peut être utilisé comme une stratégie pour prioriser variantes pour étude complémentaire. 5. Validation génétique <ol><li> Reséquencer l&#39;ensemble du gène dans le cas de patients supplémentaires (pour identifier d&#39;autres mutations causales) et dans les contrôles. Les échantillons de contrôle seront utilisés pour évaluer les fréquences alléliques des variantes priorité. Tout gène contenant au moins deux différentes mutations de novo délétères (non-sens, l&#39;épissage, des déphasages, et prédit faux-sens dommageables) a constaté chez des patients différents (mais pas dans les échantillons de contrôle ou de bases de données publiques) doivent être hautement prioritaires pour les études de validation. Cela comprend: 1) Les essais pour un défaut d&#39;épissage potentiels dans des lignées cellulaires lymphoblastoïdes dérivées du patient. Dans notre expérience, la plupart des gènes de rendement produits RT-PCR à partir des lignées cellulaires lymphoblastoïdes, 2) étudier l&#39;expression des protéines modifiées niveaux par analyse quantitative blot Western d&#39;extraits protéiques des lignées de cellules lymphoblastoïdes et 3) autre test de la mutation / gène au niveau fonctionnel animale (c elegans, poisson zèbre) et des modèles lignée cellulaire comme précédemment par notre groupe (ex: 5,6). </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Suite à ce protocole, nous avons été en mesure d&#39;identifier de nouveaux gènes de la schizophrénie et l&#39;autisme. Un exemple est notre récente découverte du gène SHANK3 (figure 2). Deux différentes mutations de novo dans SHANK3 gène, une mutation non-sens dans trois frère touchée et une mutation faux-sens dans une femme touchée. <img src="/files/ftp_upload/2534/2534fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. (A) la séparation de la mutation non-sens R1117X de trois frères de la famille affectée PED 419. Le propositus est indiquée par la flèche. (B) la ségrégation de la mutation faux-sens R536W dans le propositus, mais pas sa non-affectés frère dans PED 56.

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	<li>Bassett, A. S., Bury, A., Hodgkinson, K. A., Honer, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+fitness+in+familial+schizophrenia.">Reproductive fitness in familial schizophrenia.</a> Schizophr Res. 21, 151-160 (1996).</li><li>Jablensky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizophrenia:+manifestations,+incidence+and+course+in+different+cultures.+A+World+Health+Organization+ten-country+study.">Schizophrenia: manifestations, incidence and course in different cultures. A World Health Organization ten-country study.</a> Psychol Med Monogr. , 1-97 (1992).</li><li>Malaspina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schizophrenia+risk+and+paternal+age:+a+potential+role+for+de+novo+mutations+in+schizophrenia+vulnerability+genes.">Schizophrenia risk and paternal age: a potential role for de novo mutations in schizophrenia vulnerability genes.</a> CNS Spectr. 7, 26-29 (2002).</li><li>DeLisi, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+scan+for+linkage+to+chromosomal+regions+in+382+sibling+pairs+with+schizophrenia+or+schizoaffective+disorder.">A genome-wide scan for linkage to chromosomal regions in 382 sibling pairs with schizophrenia or schizoaffective disorder.</a> Am J Psychiatry. 159, 803-812 (2002).</li><li>Gauthier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+Novo+SHANK3+Mutations+in+Patients+Ascertained+for+Schizophrenia.">De Novo SHANK3 Mutations in Patients Ascertained for Schizophrenia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2010).</li><li>Piton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+calcium-related+gene+IL1RAPL1+are+associated+with+autism.">Mutations in the calcium-related gene IL1RAPL1 are associated with autism.</a> Hum Mol Genet. 17, 3965-3974 (2008).</li><li>Krawczak, M., Ball, E. V., Cooper, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neighboring-nucleotide+effects+on+the+rates+of+germ-line+single-base-pair+substitution+in+human+genes.">Neighboring-nucleotide effects on the rates of germ-line single-base-pair substitution in human genes.</a> Am J Hum Genet. 63, 474-488 (1998).</li></ol>

La procédure décrite ici vise à identifier des maladies courantes qui résultent probablement, en partie, de mutations de novo, et de prouver cette hypothèse. Des mutations de novo est un mécanisme bien établi pour le développement d&#39;un certain nombre de maladies, par exemple les syndromes de cancer héréditaire, mais a été peu exploré dans les maladies communes. Ce en partie le résultat des défis techniques impliqués dans l&#39;identification de mutations de novo, ce qui nécessite le séquençage de grandes quantités d&#39;ADN, qui n&#39;a que très récemment devenue rentable avec l&#39;avènement du séquençage de nouvelle génération. En outre, le taux de mutation de novo chez l&#39;homme était, jusqu&#39;à très récemment, seule une estimation. Ce n&#39;est que très récemment, at-il eu des rapports directement à la détermination du taux de mutation chez les humains. Avant ces mesures, il était difficile de prédire la taille de l&#39;échantillon nécessaire pour ce genre d&#39;étude et de déterminer si le taux observé de mutation de novo est supérieure au taux de référence. Séquençage des gènes candidats par rapport génome entier? Puisque la majorité des mutations faux-sens sont des maladies signalées / absurdités mutations sont des mutations et des sites d&#39;épissage (selon le site web HGMD) de notre stratégie de dépistage permettrait d&#39;identifier plus de 68% des mutations connues. Il ya aussi une relation claire entre la sévérité de remplacement d&#39;acides aminés et la probabilité d&#39;un phénotype clinique. Par rapport à une substitution d&#39;acide aminé conservatrices, un changement non-sens est 9,0 fois plus susceptibles de présenter cliniquement 7. Ainsi, à ce moment séquençage des gènes candidats est la stratégie la plus rentable. Le succès de la procédure décrite dépend de plusieurs étapes cruciales, qui sont décrites en détail et illustrés par deux exemples, l&#39;autisme et la schizophrénie. Il ya de nombreux pièges qui doivent être évités, tels que la maladie dont pour choisir, quels patients à l&#39;écran, la source de l&#39;ADN, et les détails de comment identifier efficacement les mutations de novo. Nous fournissons une méthode pour déterminer le plus efficacement possible la fraction des cas de toute maladie qui résulte de ces mutations spontanées.

a strategy to identify de novo mutations in common disorders such as autism and schizophrenia

Il ya plusieurs lignes de preuves appuyant le rôle des mutations de novo comme un mécanisme de troubles courants, tels que l&#39;autisme et la schizophrénie. Premièrement, le taux de mutation de novo chez l&#39;homme est relativement élevée, donc de nouvelles mutations sont générés à une fréquence élevée dans la population. Cependant, des mutations de novo n&#39;ont pas été signalés dans la plupart des maladies courantes. Des mutations dans les gènes conduisant à des maladies graves où il ya une forte sélection négative contre le phénotype, tels que la létalité dans les stades embryonnaires ou réduit la capacité de reproduction, ne seront pas transmis aux membres de famille multiples, et donc ne sera pas détecté par la cartographie génétique de liaison ou d&#39;une association des études. L&#39;observation de concordance très élevé chez les jumeaux monozygotes et de la concordance très faible chez les jumeaux dizygotes soutient aussi fortement l&#39;hypothèse selon laquelle une fraction importante de cas peuvent résulter de nouvelles mutations. Tel est le cas pour les maladies comme l&#39;autisme et la schizophrénie. Deuxièmement, malgré réduite reproduction de fitness 1 et extrêmement variable des facteurs environnementaux, l&#39;incidence de certaines maladies dans le monde entier est maintenu à un taux relativement élevé et constant. C&#39;est le cas de l&#39;autisme et la schizophrénie, avec une incidence d&#39;environ 1% dans le monde entier. La charge mutationnelle peut être considéré comme un équilibre entre la sélection pour ou contre une mutation délétère et sa production de novo de mutation. La baisse des taux de reproduction constitue un facteur de sélection négative qui devrait réduire le nombre d&#39;allèles mutants dans la population, conduisant finalement à la prévalence des maladies ont diminué. Ces pressions sélectives ont tendance à être d&#39;intensité différente dans différents environnements. Néanmoins, ces troubles mentaux graves ont été maintenus à un taux de prévalence relativement élevée constante dans la population mondiale dans un large éventail de cultures et de pays en dépit d&#39;une forte sélection négative contre eux 2. Ce n&#39;est pas ce que l&#39;on prédire les maladies avec la capacité de reproduction réduite, sauf si il y avait un taux de mutation élevé de nouvelles. Enfin, les effets de l&#39;âge paternel: il ya une augmentation significative du risque de la maladie avec l&#39;âge paternel augmente, ce qui pourrait résulter de l&#39;augmentation liée à l&#39;âge de paternelle mutations de novo. C&#39;est le cas de l&#39;autisme et la schizophrénie 3. Le ratio hommes-femmes des taux de mutation est estimé à environ 4-6:1, vraisemblablement en raison d&#39;un nombre plus élevé de cellules germinales divisions avec l&#39;âge chez les hommes. Par conséquent, on pourrait prédire que les mutations de novo serait plus fréquemment proviennent de mâles, en particulier les hommes plus âgés 4. Un taux élevé de nouvelles mutations peuvent en partie expliquer pourquoi les études génétiques ont jusqu&#39;ici échoué à identifier de nombreux gènes de prédisposition à des maladies complexes des gènes, tels que l&#39;autisme et la schizophrénie, et pourquoi les maladies ont été identifiés pour seulement 3% des gènes dans le génome humain . Identification des mutations de novo en tant que cause d&#39;une maladie nécessite une approche moléculaire ciblée, qui comprend les parents étudient et les sujets concernés. Le processus permettant de déterminer si la base génétique d&#39;une maladie peut résulter en partie de mutations de novo et de l&#39;approche moléculaire pour établir ce lien sera illustrée, en utilisant autisme et la schizophrénie comme exemples.

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A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

Stratégie génétique moléculaire pour trouver des mutations de novo provoquant des troubles courants tels que l&#39;autisme et la schizophrénie.

Une stratégie pour identifier des mutations de novo dans les troubles courants comme l&#39;autisme et la schizophrénie

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

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Research

JoVE Journal

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25.6K vues.  Universite de Montreal. Stratégie génétique moléculaire pour trouver des mutations de novo provoquant des troubles courants tels que l'autisme et la schizophrénie.

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Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We have established bilateral common carotid artery occlusion as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to transient focal cerebral ischemia in C57Bl6/J mice. In this video, we will demonstrate the methodology used for this study.

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning (PC) &#x2013; a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We established bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO) as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance (IT) to transient focal cerebral ischemia (induced by middle cerebral artery occlusion, MCAO) in C57Bl6/J mice.

Occlusion bilatérale de l&#39;artère carotide commune comme un stimulus suffisant pour provoquer le préconditionnement précoce Tolérance ischémique à une ischémie cérébrale focale

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a ...

Recherche

Médecine

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for personalized medicine after stratification, explaining the current interest in developing a reproducible and low-cost xenotransplant model for this disease. The chick chorioallantoic membrane is a natural immunodeficient host capable of sustaining grafted tissues and cells without species-specific restrictions. In addition, it is easily accessed, manipulated and imaged using optical and fluorescence stereomicroscopy. Histology further allows detailed analysis of heterotypic cellular interactions.
This protocol describes in detail the in ovo grafting of the chorioallantoic membrane with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines (Saos-2 and SW1353). The chick survival rates are up to 75%. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior. For localized grafting of single cell suspensions, ECM gel provides significant advantages over inert containment materials. The Ki67 proliferation index is related to the distance of the cells from the surface of the CAM and the duration of application on the CAM, the latter determining a time frame for the addition of therapeutic products.

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

The in ovo chorioallantoic membrane (CAM) is grafted with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior.

Le<em&gt; En ovo</em&gt; CAM-test comme un Xenograftmodel pour le sarcome

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

Bladder Smooth Muscle Strip Contractility as a Method to Evaluate Lower Urinary Tract Pharmacology

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties of the smooth muscle as well as changes induced by pathology. This method provides critical information for understanding bladder function while overcoming major methodological difficulties encountered in in vivo experiments, such as surgical and pharmacological manipulations that affect stability and survival of the preparations, the use of human tissue, and/or the use of expensive chemicals. It also provides a way to investigate the properties of each bladder component (i.e. smooth muscle, mucosa, nerves) in healthy and pathological conditions.
The urinary bladder is removed from an anesthetized animal, placed in Krebs solution and cut into strips. Strips are placed into a chamber filled with warm Krebs solution. One end is attached to an isometric tension transducer to measure contraction force, the other end is attached to a fixed rod. Tissue is stimulated by directly adding compounds to the bath or by electric field stimulation electrodes that activate nerves, similar to triggering bladder contractions in vivo. We demonstrate the use of this method to evaluate spontaneous smooth muscle contractility during development and after an experimental spinal cord injury, the nature of neurotransmission (transmitters and receptors involved), factors involved in modulation of smooth muscle activity, the role of individual bladder components, and species and organ differences in response to pharmacological agents. Additionally, it could be used for investigating intracellular pathways involved in contraction and/or relaxation of the smooth muscle, drug structure-activity relationships and evaluation of transmitter release.
The in vitro smooth muscle contractility method has been used extensively for over 50 years, and has provided data that significantly contributed to our understanding of bladder function as well as to pharmaceutical development of compounds currently used clinically for bladder management.

This manuscript presents a simple, yet powerful, in vitro method for evaluating smooth muscle contractility in response to pharmacological agents or nerve stimulation. Main applications are drug screening and understanding tissue physiology, pharmacology,&#160;and pathology.

Vessie muscle lisse bande de contractilité comme une méthode pour évaluer urinaires inférieures Pharmacologie

We describe an in vitro method to measure bladder smooth muscle contractility, and its use for investigating physiological and pharmacological properties ...

Fundus Photography as a Convenient Tool to Study Microvascular Responses to Cardiovascular Disease Risk Factors in Epidemiological Studies

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an important role in maintaining cardiovascular health. The retina is a tissue that lines the interior of the eye and it is the only tissue that allows for a non-invasive analysis of the microvasculature. Nowadays, high-quality fundus images can be acquired using digital cameras. Retinal images can be collected in 5 min or less, even without dilatation of the pupils. This unobtrusive and fast procedure for visualizing the microcirculation is attractive to apply in epidemiological studies and to monitor cardiovascular health from early age up to old age.
Systemic diseases that affect the circulation can result in progressive morphological changes in the retinal vasculature. For example, changes in the vessel calibers of retinal arteries and veins have been associated with hypertension, atherosclerosis, and increased risk of stroke and myocardial infarction. The vessel widths are derived using image analysis software and the width of the six largest arteries and veins are summarized in the Central Retinal Arteriolar Equivalent (CRAE) and the Central Retinal Venular Equivalent (CRVE). The latter features have been shown useful to study the impact of modifiable lifestyle and environmental cardiovascular disease risk factors.
The procedures to acquire fundus images and the analysis steps to obtain CRAE and CRVE are described. Coefficients of variation of repeated measures of CRAE and CRVE are less than 2% and within-rater reliability is very high. Using a panel study, the rapid response of the retinal vessel calibers to short-term changes in particulate air pollution, a known risk factor for cardiovascular mortality and morbidity, is reported. In conclusion, retinal imaging is proposed as a convenient and instrumental tool for epidemiological studies to study microvascular responses to cardiovascular disease risk factors.

Retinal image analysis is an unobtrusive procedure for visualizing the microcirculation. The impact of cardiovascular disease risk factors can result in changes of retinal vessel calibers. The procedures to acquire fundus images and the steps for calculating the vessel calibers are described.

Photographie fond comme un outil pratique pour étudier les réponses microvasculaires à des facteurs de risque de maladie cardiovasculaire dans les études épidémiologiques

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an ...

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been shown to effectively induce humoral and cellular responses at systemic and mucosal sites, namely the lungs and urogenital tract. Sublingual vaccination can promote protection against infections at the lower and upper respiratory tract; it can also promote tolerance to allergens and ameliorate asthma symptoms. Modulation of lung&#8217;s immune response by sublingual immunotherapy (SLIT) is safer than direct administration of formulations by intranasal route because it does not require delivery of potentially harmful molecules directly into the airways. In contrast to intranasal delivery, side effects involving brain toxicity or facial paralysis are not promoted by SLIT. The immune mechanisms underlying SLIT remain elusive and its use for the treatment of acute lung infections has not yet been explored. Thus, development of appropriate animal models of SLIT is needed to further explore its potential advantages. 
This work shows how to perform sublingual administration of therapeutic agents in mice to evaluate their ability to protect against acute pneumococcal pneumonia. Technical aspects of mouse handling during sublingual inoculation, precise identification of sublingual mucosa, draining lymph nodes and isolation of tissues, bronchoalveolar lavage and lungs are illustrated. Protocols for single cell suspension preparation for FACS analysis are described in detail. Other downstream applications for the analysis of the immune response are discussed. Technical aspects of the preparation of Streptococcus pneumoniae inoculum and intranasal challenge of mice are also explained.
SLIT is a simple technique that allows screening of candidate molecules to modulate lungs&#8217; immune response. Parameters affecting the success of SLIT are related to molecular size, susceptibility to degradation and stability of highly concentrated formulations.

The present work illustrates the convenience of using sublingual immunotherapy to boost the innate immune response in the lungs and confer protection against acute pneumococcal pneumonia in mouse.

L&#39;immunothérapie sublinguale comme une alternative à induire une protection contre les infections respiratoires aiguës

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes (ILM), and in conjunction with astrocytes, pericytes and endothelial cells they establish the blood-retinal barrier (BRB). BRB limits material transport between the bloodstream and the retina while the ILM acts as a basement membrane that defines histologically the border between the retina and the vitreous cavity. Labeling M&#252;ller cells is particularly relevant to study the physical state of the retinal barriers, as these cells are an integral part of the BRB and ILM. Both BRB and ILM are frequently altered in retinal disease and are responsible for disease symptoms.
There are several well-established methods to study the integrity of the BRB, such as the Evans blue assay or fluorescein angiography. However these methods do not provide information on the extent of BRB permeability to larger molecules, in nanometer range. Furthermore, they do not provide information on the state of other retinal barriers such as the ILM. To study BRB permeability alongside retinal ILM, we used an AAV based method that provides information on permeability of BRB to larger molecules while indicating the state of the ILM and extracellular matrix proteins in disease states. Two AAV variants are useful for such study: AAV5 and ShH10. AAV5&#160;has a natural tropism for photoreceptors but it cannot get across to the outer retina when administered into the vitreous when the ILM is intact (i.e., in wild-type retinas). ShH10 has a strong tropism towards glial cells and will selectively label M&#252;ller glia in both healthy and diseased retinas. ShH10 provides more efficient gene delivery in retinas where ILM is compromised. These viral tools coupled with immunohistochemistry and blood-DNA analysis shed light onto the state of retinal barriers in disease.

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

Utilisant le virus adéno-associé comme un outil pour étudier les obstacles dans la maladie de la rétine

M&#252;ller cells are the principal glial cells of the retina. Their end-feet form the limits of the retina at the outer and inner limiting membranes ...

Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide new expandable sources of beta cells to alleviate the donor scarcity in human islet transplantation as therapy for diabetes. Although recent advances have been made towards this aim, mechanisms that regulate beta cell expansion and differentiation from a stem/progenitor cell remain to be characterized. Here, we describe a protocol for an injury model in the adult mouse pancreas that can function as a tool to study mechanisms of tissue remodeling and beta cell proliferation and differentiation. Partial duct ligation (PDL) is an experimentally induced injury of the rodent pancreas involving surgical ligation of the main pancreatic duct resulting in an obstruction of drainage of exocrine products out of the tail region of the pancreas. The inflicted damage induces acinar atrophy, immune cell infiltration and severe tissue remodeling. We have previously reported the activation of Neurogenin (Ngn) 3 expressing endogenous progenitor-like cells and an increase in beta cell proliferation after PDL. Therefore, PDL provides a basis to study signals involved in beta cell dynamics and the properties of an endocrine progenitor in adult pancreas. Since, it still remains largely unclear, which factors and pathways contribute to beta cell neogenesis and proliferation in PDL, a standardized protocol for PDL will allow for comparison across laboratories.

This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation.

Blessure chirurgicale au pancréas de souris par ligature du canal pancréatique tant que modèle de endocrines et exocrines Reprogrammation et prolifération

Expansion of pancreatic beta cells in vivo or ex vivo, or generation of beta cells by differentiation from an embryonic or adult stem cell, can provide ...

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves focal endothelial-selective transgenesis, thereby allowing an investigator to determine the biological roles of endothelial-expressed transgenes and to quantify the in vivo transcriptional activity of DNA sequences in large artery endothelial cells. The method uses surgical isolation of rabbit common carotid arteries and an arteriotomy to deliver a transgene-expressing viral vector into the arterial lumen. A short incubation period of the vector in the lumen, with subsequent aspiration of the lumen contents, is sufficient to achieve efficient and durable expression of the transgene in the endothelium, with no detectable transduction or expression outside of the isolated arterial segment. The method allows assessment of the biological activities of transgene products both in normal arteries and in models of human vascular disease, while avoiding systemic effects that could be caused either by targeting gene delivery to other sites (e.g. the liver) or by the alternative approach of delivering genetic constructs to the endothelium by germ line transgenesis. Application of the method is limited by the need for a skilled surgeon and anesthetist, a well-equipped operating room, the costs of purchasing and housing rabbits, and the need for expertise in gene-transfer vector construction and use. Results obtained with this method include: transgene-related alterations in arterial structure, cellularity, extracellular matrix, or vasomotor function; increases or reductions in arterial inflammation; alterations in vascular cell apoptosis; and progression, retardation, or regression of diseases such as intimal hyperplasia or atherosclerosis. The method also allows measurement of the ability of native and synthetic DNA regulatory sequences to alter transgene expression in endothelial cells, providing results that include: levels of transgene mRNA, levels of transgene protein, and levels of transgene enzymatic activity.

In Vivo Gene Transfer to the Rabbit Common Carotid Artery Endothelium

This method is to introduce a transgene into the endothelium of rabbit carotid arteries. Introduction of the transgene allows the assessment of the biological role of the transgene product either in normal arteries or disease models. The method is also useful for measuring activity of DNA regulatory sequences.

In Vivo Transfert de gènes à l’endothélium de l’artère carotide commune lapin

The goal of this method is to introduce a transgene into the endothelium of isolated segments of both rabbit common carotid arteries. The method achieves ...

An Experimental Model of Diet-Induced Metabolic Syndrome in Rabbit: Methodological Considerations, Development, and Assessment

In recent years, obesity and metabolic syndrome (MetS) have become a growing problem for public health and clinical practice, given their increased prevalence due to the rise of sedentary lifestyles and unhealthy eating habits. Thanks to animal models, basic research can investigate the mechanisms underlying pathological processes such as MetS. Here, we describe the methods used to develop an experimental rabbit model of diet-induced MetS and its assessment. After a period of acclimation, animals are fed a high-fat (10% hydrogenated coconut oil and 5% lard), high-sucrose (15% sucrose dissolved in water) diet for 28 weeks. During this period, several experimental procedures were performed to evaluate the different components of MetS: morphological and blood pressure measurements, glucose tolerance determination, and the analysis of several plasma markers. At the end of the experimental period, animals developed central obesity, mild hypertension, pre-diabetes, and dyslipidemia with low HDL, high LDL, and an increase of triglyceride (TG) levels, thus reproducing the main components of human MetS. This chronic model allows new perspectives for understanding the underlying mechanisms in the progression of the disease, the detection of preclinical and clinical markers that allow the identification of patients at risk, or even the testing of new therapeutic approaches for the treatment of this complex pathology.

We describe methods to develop an experimental model of diet-induced metabolic syndrome (MetS) in rabbits using a high-fat, high-sucrose diet. Animals developed central obesity, mild hypertension, pre-diabetes, and dyslipidemia, thus reproducing the main components of human MetS. This chronic model will allow acquisition of knowledge underlying mechanisms of disease progression.

Un modèle expérimental du Syndrome métabolique induite par l’alimentation chez le lapin : considérations méthodologiques, développement et évaluation

In recent years, obesity and metabolic syndrome (MetS) have become a growing problem for public health and clinical practice, given their increased ...

A Rabbit Model of Durable Transgene Expression in Jugular Vein to Common Carotid Artery Interposition Grafts

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, intimal hyperplasia, and atherosclerosis. The goal of this article is to demonstrate a method for placing bilateral venous interposition grafts in a rabbit, then transducing the grafts with a gene transfer vector that achieves durable transgene expression. The method allows the investigation of the biological roles of genes and their protein products in normal vein graft homeostasis. It also allows the testing of transgenes for the activities that could prevent vein graft failure, e.g., whether the expression of a transgene prevents the neointimal growth, reduces the vascular inflammation, or reduces atherosclerosis in rabbits fed with a high-fat diet. During an initial survival surgery, the segments of right and left external jugular vein are excised and placed bilaterally as reversed end-to-side common carotid artery interposition grafts. During a second survival surgery, performed 28 days later, each of the grafts is isolated from the circulation with vascular clips and the lumens are filled (via an arteriotomy) with a solution containing a helper-dependent adenoviral (HDAd) vector. After a 20-min incubation, the vector solution is aspirated, the arteriotomy is repaired, and flow is restored. The veins are harvested at time points dictated by individual experimental protocols. The 28-day delay between the graft placement and the transduction is necessary to ensure the adaptation of the vein graft to the arterial circulation. This adaptation avoids rapid loss of transgene expression that occurs in vein grafts transduced before or immediately after grafting. The method is unique in its ability to achieve durable, stable transgene expression in grafted veins. Compared to other large animal vein graft models, rabbits have advantages of low cost and easy handling. Compared to rodent vein graft models, rabbits have larger and easier-to-manipulate blood vessels that provide abundant tissue for analysis.

This method describes the placement of interposition vein grafts in rabbits, the transduction of the grafts, and the achievement of durable transgene expression. This allows the investigation of physiological and pathological roles of transgenes and their protein products in grafted veins, and testing of gene therapies for vein graft disease.

Un modèle de lapin d’Expression du transgène durables dans la veine jugulaire à des greffes d’Interposition artère carotide commune

Vein graft bypass surgery is a common treatment for occlusive arterial disease; however, long-term success is limited by graft failure due to thrombosis, ...