Nous reconnaissons l&#39;appui de Summer Research Fellowship d&#39;un Duke University Dean (AN), l&#39;American Heart Association (AHA) bourse 11POST7160006 (CG), National Institutes of Health (NIH) des subventions R01-EY021872 du National Eye Institute (EED), R01HD04260 de l&#39; Institut national de la santé infantile et le développement (NK), R01DK072301 et R01DK075972 de l&#39;Institut national de la Digestive du diabète et des troubles rénaux (NK), et l&#39;Union européenne (Financé par l&#39;UE 7 e PC sous AG nr 241955, projet SYSCILIA;. EED, NK) NK est un éminent Jean et George W. Brumley professeur.

1. Bioinformatique Analyse <ol><li> Déterminer si le gène humain d&#39;intérêt a un orthologue poisson zèbre, et si oui, combien de copies. Nous recommandons BLAST réciproque ( <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/</a> ) de la protéine humaine contre génome du poisson zèbre, et BLAST ultérieure du meilleur poisson-zèbre frapper contre le génome humain. Vrai orthologues sera le meilleur succès dans chaque cas. </li><li> Déterminer la taille de la phase ouverte de lecture (ORF) du gène humain. Si plus de 6 kb, ce modèle est intraitable à l&#39;heure actuelle en raison des limitations de haute qualité dans la transcription in vitro de longues modèles. </li><li> Obtenir ou générer une construction contenant l&#39;ORF humains dans le pCS2 + squelette du vecteur (ou vecteur équivalent avec un 5 &#39;SP6 site de transcription et 3 «signal polyA). </li><li> Concevoir un MO pour bloquer l&#39;épissage ou la traduction du gène de poisson zèbre ciblée. Si plusieurs copies existent dans le génome du poisson zèbre, there sont deux options: a) la conception d&#39;OM supplémentaire, ou b) l&#39;identification d&#39;un site d&#39;épissage entièrement conservée entre copies contre lequel un seul MO peuvent être efficaces. Certaines séquences MO publiés sont disponibles à <a href="http://www.zfin.org" target="_blank">www.zfin.org</a> . </li></ol> 2. analyse de l&#39;expression dans l&#39;embryon de poisson zèbre développement <ol><li> Déterminer si le poisson zèbre orthologue est exprimé dans un contexte spatio-temporel pertinent pour la lecture phénotypique. S&#39;il n&#39;y a pas de données d&#39;expression sont disponibles pour le gène d&#39;intérêt, effectuer la transcription inverse (RT)-PCR en utilisant l&#39;ADNc à partir de l&#39;ensemble des embryons de poisson zèbre ou l&#39;hybridation in situ. (Voir 2,3). </li></ol> 3. Mutagenèse dirigée <ol><li> Concevoir des amorces de mutagenèse 25-45 bases de longueur, avec la mutation désirée dans le centre. La température de fusion de l&#39;amorce doit être supérieure ou égale à 78 ° C. Concevoir une amorce de mutagenèse avant et arrière pour recuire à facebrins du plasmide. </li><li> Amorces pour obtenir confirmation de la séquence de l&#39;ORF post-mutagenèse, qui devraient tuile à travers environ 300 sections de paires de bases pour couvrir l&#39;ensemble de l&#39;ORF. </li><li> Monter la réaction de mutagenèse d&#39;une polymérase haute fidélité et le cycle qui suit (1: 95 ° C 30 sec, 2: 95 ° C 30 sec, 3: 55 ° C 1 min, 4: 68 ° C 6 minutes, 5: Go à 2 x18, 6: 4 ° C pour toujours, 7: fin). </li><li> Ajouter 1 ul endonucléase de restriction DpnI par réaction d&#39;enlever barrage modèle méthylé; incuber à 37 ° C pendant 2 heures. </li><li> Transformer 2 pi de réaction de mutagenèse en 20 cellules compétentes ul selon des protocoles standards. </li><li> Choisissez 3-4 colonies et inoculer 5 ml de milieu LB contenant de l&#39;antibiotique approprié. Agiter à 37 ° C pendant la nuit à 225 rpm. </li><li> ADN Miniprep et déterminer la concentration. </li><li> Séquence du site de mutation pour confirmer la présence de la mutation d&#39;intérêt. </li><li> Toute la séquence de l&#39;orf pour confirmer l&#39;intégrité de la séquence. </li></ol> 4. ARNm transcription in vitro en <ol><li> L&#39;utilisation d&#39;un linéarisé pCS2 + modèle, générer des ARNm coiffé en utilisant le kit SP6 mMachine mMessage (Ambion). Nous vous recommandons d&#39;utiliser la moitié des quantités de composants de la réaction. </li><li> Purifier l&#39;échantillon d&#39;ARN avec des précipitations LiCl ou phénol-chloroforme comme décrit dans les instructions du kit. </li><li> Déterminer la concentration de l&#39;ARNm en utilisant l&#39;absorbance, d&#39;assurer l&#39;intégrité de l&#39;ARNm par électrophorèse sur gel, et stocker l&#39;échantillon en trois ou plusieurs portions à -80 ° C jusqu&#39;au moment de son utilisation. Nous ne recommandons pas de multiples cycles de gel-dégel des portions d&#39;ARNm. </li></ol> 5. Essai in vivo de la variante Perte fonctionnelle <ol><li> Obtenir des embryons de poisson zèbre à partir de croisements de poisson zèbre naturelles, et de les maintenir à 28 ° C dans l&#39;eau de l&#39;embryon dans 6 ou 10 plats cm. </li><li> Réaliser une courbe dose-réponse morpholino d&#39;évaluer la spécificité du phénotype, l&#39;efficacité et la toxicité MO MO. Injecter une courbe de dosage d&#39;autrois concentrations moindres différents entre 1-10 ng MO dans 50-100 (stade de la cellule 1-4) poisson zèbre embryons / batch. OM efficaces devraient donner lieu à une augmentation dose-dépendante de la proportion d&#39;embryons affectés dans un lot. </li><li> embryons phénotypiques au stade de développement approprié basé sur l&#39;expression du gène de poisson zèbre ciblée d&#39;intérêt et le stade auquel un phénotype pertinent sera observée. Cela peut être soit quantitative (comme une mesure entre les structures anatomiques) ou qualitative (basée sur des critères phénotypiques standardisés). Pour toutes les injections ont marqué&gt; 24 HPF: embryons doivent être traités avec PTU (0,003% 1-phényl-2-thiourée dans les médias d&#39;embryons) à 24 HPF pour réduire au maximum la formation des mélanocytes. </li><li> Pour épissure-blocage OM, tester l&#39;efficacité MO par extraction de l&#39;ARN total de l&#39;ensemble embryon lysats au point de marquer phénotypique de temps, générer et diriger ADNc par RT-PCR du gène cible en utilisant des amorces flanquant le site cible MO. </li><li> Pour vérifier l&#39;effic de suppressioniency d&#39;un TB-MO, récolte lysats protéiques de l&#39;embryon et de mener des immuno pour comparer les niveaux de la protéine par rapport à un contrôle ciblé. Cependant, cette approche ne se prête pas à tous les gènes cibles parce qu&#39;il ya une réactivité croisée limitée pour de nombreux anticorps commerciaux aux protéines de poisson zèbre. Deux méthodes indirectes de montrer MO spécificité, notamment: a) démontre qu&#39;il existe un effet dose-dépendant sur le phénotype, et b) montrant que la co-injection de l&#39;ARNm de type sauvage avec TB-MO sauve le phénotype efficacement. Pour ces raisons, nous recommandons un bloqueur d&#39;épissure lorsque cela est possible parce que l&#39;efficacité peut être contrôlé directement. </li><li> Si un phénotype est observé passez à l&#39;étape 5.7, si aucun phénotype est observé passez à l&#39;étape 6.1. </li><li> Pour phénotypes qualitatifs, sélectionnez une dose MO où 50-75% des embryons sont touchés, car phénotypes quantitatifs, sélectionnez une dose MO dans lequel la mesure phénotypique est significativement différente de type sauvage (p &lt;0,001). Injecter de nouveaux lots de poisson zèbre embryô (étape 4.1 de cellules, n = 50-100/batch) avec un cocktail contenant la dose &quot;d&#39;essai&quot; de la MO et une courbe de dosage de l&#39;ARNm de WT humaine (variant de 10 à 200 pg de l&#39;ARNm; ces doses assurer surexpression substantielle au-dessus la base d&#39;une seule transcription, soit 0,25-0,5% de l&#39;ARNm total polyA dans un embryon de poisson zèbre). 4 </li><li> Mener notation masqué des lots d&#39;injection; choisir la dose de l&#39;ARNm WT avec le sauvetage le plus important par rapport à MO seul, c&#39;est la dose »de dosage&quot; de l&#39;ARNm. </li><li> Injecter de nouveaux lots (stade de la cellule 1-4, n = 50-100/batch) avec la dose d&#39;essai de MO et de la dose d&#39;essai de l&#39;ARNm humain mutant. embryons phénotypiques au stade approprié et comparer les résultats à WT sauvetage de l&#39;ARNm humain à l&#39;aide d&#39;un test statistique approprié (t-test ou chi-carré). Voir la Figure 1 pour les résultats et passez à l&#39;étape 7. Injecter les doses d&#39;essai de WT et de l&#39;ARNm mutant seul à contrôler les effets de la toxicité de l&#39;ARNm. </li></ol> 6. Essai in vivo de la variante Dominante négative ou Gain des effets de fonction <ol><li> Si aucune perte de fonction phénotype est observé (étape 5.5) ou si l&#39;ARNm mutant donne lieu à des phénotypes pas significativement différentes de MO seul (étape 5.7), injecter une courbe de dosage allant de 10 à 200 pg WT ARNm humain (nous recommandons 25, 50 , et 100 pg comme un test initial) en lots d&#39;embryons (stade 1-4 cellulaire; 50-100 embryons / lot). </li><li> Au stade approprié (voir 5.3 ci-dessus), effectuer score phénotypique, et de déterminer la dose la plus élevée à laquelle il n&#39;y a pas un nombre statistiquement significatif d&#39;embryons morts et / ou affectées par rapport aux contrôles non-injecté. Il s&#39;agit de la dose &quot;d&#39;essai&quot;. </li><li> Injecter la dose d&#39;essai de l&#39;ARNm humain mutant (stade 1-4 cellulaire; 50-100 embryons / lot). embryons phénotypiques et comparer les résultats à la notation de la dose d&#39;essai de l&#39;injection d&#39;ARNm humain WT ou la concentration MO de dosage. Voir la Figure 1 pour les résultats. </li><li> Si les résultats sont indiscernables de MO, titrer ARNm mutant humain avec l&#39;ARNm WTet comparez-WT humaine et injections d&#39;ARNm mutant. Amélioration des phénotypes avec des lots ARNm injectés mutantes ainsi WT indique un dominant négatif. Aucune amélioration indique un gain de fonction. </li></ol> 7. Reproduire des résultats des essais in vivo <ol><li> Répéter les essais in vivo d&#39;un minimum de trois fois. </li></ol> 8. Intégrer poisson zèbre Données de pathogénicité in vivo avec autres sources de données <ol><li> Comparer les données de pathogénicité obtenus à partir d&#39;expériences de poisson zèbre à: données génétiques au sein d&#39;un pedigree (le cas échéant), les données de fréquence de la population de contrôle, des études in vitro (tests basés sur les cellules de la stabilité des protéines, la localisation cellulaire, sortie de signalisation ou l&#39;activité enzymatique). </li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Les méthodes décrites ici représentent un protocole général applicable à l&#39;analyse des changements non synonymes associés à une variété de phénotypes de maladies génétiques humaines (tableau 2, figure 3). Nos approches se sont révélées utiles pour évaluer l&#39;impact potentiel de variation sur les phénotypes de la maladie, et d&#39;aider à disséquer les mécanismes des maladies (telles que la contribution des mutations dominantes négatives au syndrome de Bardet-Biedl, une maladie récessive autosomique principalement 17). À ce jour, grâce à l&#39;élaboration de l&#39;arbre de décision présenté, nous avons modélisé au coût et délai raisonnable au-delà de 200 gènes causalement liés à des troubles génétiques, à un excès d&#39;allèles 1000. Bien que n&#39;étant pas discuté en détail ici, nous avons également montré que ces méthodes sont appropriées pour modéliser d&#39;autres types de lésions génétiques, comme copie variation du nombre de copies (CNV), ainsi que et génétique des interactions. Les analyses de ces événements sont au-delà de la portée dela présente description de la méthode, même si elles reposent fondamentalement sur le même principe du test systématique des gènes candidats (y compris les paires de gènes injectés simultanément) afin de déterminer l&#39;induction ou l&#39;exacerbation des phénotypes cliniquement appropriées. Par exemple, pour élucider lequel des 29 gènes dans le 16p11.2 CNV pourrait être pertinent à la microcéphalie observée chez les patients ayant des duplications d&#39;un segment génomique 660 kb, les ARNm correspondant à chacun des 29 gènes dans le secteur ont été injectés et la tête mesures de taille ont été réalisées à 2 DPF et 5 DPF, révélant une contribution majeure d&#39;un seul transcrit, KCTD13. 21 En outre, nous avons utilisé ce modèle pour les interactions génétiques d&#39;analyse de lésions génomiques chez les patients ayant à la fois le syndrome de Bardet-Biedl et la maladie de Hirschsprung. 22 En comparaison de MO suppression des gènes causaux des deux identités cliniques séparément et simultanément, nous avons pu identifier le phénotype résultant de being Une interaction synergique plutôt que de simplement la gravité de l&#39;additif. Malgré avoir établi une sensibilité élevée (98%) et la spécificité (&gt; 82%) pour les variantes qui contribuent à ciliopathies 17, nous n&#39;avons pas encore suffisamment de données pour déterminer si elles sont généralisables à tous les indicateurs phénotypiques dans les modèles de poisson-zèbre. Pour ce faire, un grand nombre d&#39;allèles, prédit génétiquement pour être bénignes ou pathogènes, doivent être testés dans chaque catégorie phénotypique. Cela sera particulièrement important pour la mise en œuvre de ces tests en milieu clinique, dans laquelle l&#39;interprétation fonctionnelle de VUSs peut informer diagnostic et le traitement seulement si une compréhension solide de faux positifs et de faux négatifs peut accompagner la livraison des résultats aux médecins et aux patients. Néanmoins, ces méthodes peuvent contribuer de manière significative à une meilleure compréhension du paysage de maladies génétiques humaines. Nous prévoyons que ces modèles ne seront pas seulement servir de fondationdation pour une meilleure interprétation de l&#39;information génétique clinique, mais également être utilisé comme des modèles utiles pour mener écrans thérapeutiques. données in vivo peut également être comparé à in silico des prédictions informatiques provenant de sources telles que PolyPhen 23, tamiser 24 SNPs &amp; GO 25, ou MutPred 26 pour montrer concordance. A noter que dans une étude précédente de prédiction bases de données SNP &amp; GO et MutPred ont été jugées les plus précis, avec une précision atteignant seulement 0,82 et 0,81, respectivement 27. Bien que nous ayons décrit la robustesse de ces méthodes pour un sous-ensemble de défauts anatomiques pédiatriques (tableau 2, figure 3), certains phénotypes sont moins dociles par ces méthodes. Certaines exceptions nonobstant, il ya trois grandes catégories de troubles ne se prêtent pas à notre protocole. Troubles à l&#39;âge adulte (comme la maladie de Parkinson) représentent un défi pour modèle dans un système embryonnaire. Ralentissez progression phénotypes dégénératives (comme la démence fronto-temporale) peuvent nécessiter plus de temps que la fenêtre du DPF sept activité MO pour produire un phénotype. D&#39;autres technologies de knockdown de gènes tels que l&#39;ARNi et siRNA sont disponibles pour interférer ou dégrader le gène cible, mais il a été démontré qu&#39;aucun n&#39;est aussi précis, stable, non toxique, ou de longue durée comme OM 28, ce qui limite aussi le calendrier pour le phénotypage. Troisièmement, certaines structures vertébrés, tels que les poumons des mammifères, n&#39;ont pas une structure suffisamment orthologue chez l&#39;embryon de poisson zèbre. Nous avons également prévu un plan d&#39;urgence proposé pour enquêter sur les cas dans lesquels l&#39;injection d&#39;ARNm humain WT conduit à un phénotype, mais nous mettons en garde s&#39;agit d&#39;une situation inhabituelle et indésirable. Certains phénotypes de la maladie peuvent alors exiger un plus grand degré d&#39;abstraction et de la maternité de substitution. Il est possible que la fonction du gène a divergé assez pour affaiblir la ressemblance phénotypique entre le modèle et true phénotype, ou que le poisson-zèbre physiologie complique intrinsèquement les effets de la maladie induite. Dans de tels cas, nous proposons en outre dissection du phénotype produite avant le licenciement. Nous avons réalisé quelques exemples réussis dans lequel phénotypes problématiques pour ce test ont été modélisés dans embryons de poissons zèbres. Par exemple, des mutations dans TCF8, un gène associé à Fuchs dystrophie cornéenne (FCD), ont été analysés en utilisant notre protocole en utilisant les défauts de gastrulation comme une lecture phénotypique de substitution basé sur les rôles connus de cette transcription dans le développement précoce. 29 Dans d&#39;autres cas, comme comme la dystrophie musculaire de l&#39;adulte causée par des mutations dans DNAJB6, nous avons pu générer des phénotypes de fibres musculaires dans les embryons 5dpf malgré le fait que les humains sont dépourvus de muscle appréciable pathologie dans leurs trois ou quatre premières années de la vie. 19 En plus des modèles mutants transitoires présentés ici, d&#39;autres ont également pris Advantage de ce système transitoire pour modéliser les maladies humaines dans une variété de systèmes de l&#39;organisme. Dans un exemple, la rétinite pigmentaire a été modélisée chez le poisson zèbre par le renversement de la RP2 du gène, entraînant la mort des cellules rétiniennes et une diminution de lamination rétine. Rescue avec l&#39;ARNm humain de type sauvage a entraîné le développement de toutes les trois couches de lamination rétine, tandis que quatre sur cinq ARNm mutant n&#39;a pas réussi à sauver. 30 Bien que ce modèle d&#39;un trouble sensoriel humain est basé sur un phénotype morphologique, il est également possible d&#39; réponse de dosage à des stimuli tels que le sursaut acoustique ou préimpulsion inhibition 47. Récemment, un modèle de poisson zèbre a été utilisée pour étudier la pathogenèse de la maladie d&#39;Alzheimer à travers la protéine précurseur de l&#39;amyloïde. 31 Les auteurs ont montré que inactivation génique a causé une déficience croissance axonale des neurones moteurs, qui pourraient être sauvées avec un ARNm humain. Ce modèle s&#39;est avéré particulièrement instructif, comme des modèles de souris affichent seulement phenot subtileYPES (knockdown simple) ou létalité post-natal (deux knockdown). La capacité d&#39;évaluer les embryons de poisson zèbre in vivo au cours du développement a permis de discerner l&#39;effet pathogène de la réduction de la protéine précurseur de l&#39;amyloïde, ainsi que fourni des preuves directes que la protéine nécessite à la fois un domaine extracellulaire et intracellulaire pour le bon fonctionnement. Autres modèles notables comprennent que des dystrophies musculaires supplémentaires 32, Blackfan Diamond anémie 33, syndrome Axenfeld-Reiger (développement oculaire et craniofaciale) 34, la maladie inflammatoire de l&#39;intestin 35 (activité antibactérienne), la maladie de Parkinson 36 (neurone et la perte de locomotion), et la saisie 37 (hydrocéphalie et l&#39;hyperactivité). Plus courantes sont les lignes de poisson zèbre mutant qui ont été montrés aussi de récapituler un phénotype de la maladie humaine. Revue en 1,38, les modèles comprennent la leucémie, le mélanome, cardiomyopathies dilatées, la dystrophie musculaire de Duchenne,et bien d&#39;autres.

L&#39;interprétation fonctionnelle de l&#39;information génétique et l&#39;affectation de la valeur clinique prédictive à un génotype représente un problème majeur en génétique médicale et devient de plus en plus poignant avec l&#39;accélération de la faisabilité technique et économique du séquençage du génome entier. Par conséquent, il est nécessaire de développer et mettre en œuvre de nouveaux paradigmes pour tester la pathogénicité des variants de signification inconnue (VUS) détectés chez les patients. Ces tests doivent alors être précis, le temps et le coût-efficacité, et le port le potentiel de catalyser une transition à l&#39;utilité clinique. Alors que la souris a été traditionnellement l&#39;outil de choix dans le domaine de la modélisation des maladies humaines, le poisson-zèbre sont en train de devenir un substitut scientifiquement et économiquement favorable. Contrairement à la souris, poisson zèbre biologie permet un accès facile et rapide à tous les stades de développement, aidés par la clarté optique d&#39;embryons qui permet l&#39;imagerie en temps réel des pathologies en développement. <sup&gt; 1 La génération relativement récente de lignes de poisson zèbre mutant a fourni des tests supplémentaires et des options de modélisation, utilisé par beaucoup dans les études fonctionnelles, mais cette technologie reste limité (revue dans 1,38). Non seulement les mutants génétiques avec Knock-in de mutations spécifiques laborieux à atteindre, ils ne sont pas favorable à l&#39;analyse à moyen ou à haut débit pour l&#39;essai d&#39;une série de mutations dans un seul gène. Surtout, une seule suite de tests peut fournir des informations non seulement pour le potentiel pathogène des allèles, mais aussi pour la direction de l&#39;effet au niveau cellulaire (par exemple, perte de la fonction vs gain de fonction), ce qui est essentiel pour le mode de transmission informer dans les familles, en particulier lorsque de petites pedigrees humaines recèlent peu d&#39;informations sur le mode de transmission génétique. Pour une comparaison de l&#39;utilisation des souris disponibles et les modèles de poisson-zèbre, voir tableau 1. Nous notons également que lere des limites inhérentes au système de modèle de poisson zèbre. Bien D. rerio ont développement initial rapide des systèmes d&#39;organes, la maturité sexuelle nécessite environ trois mois. Pour cette raison, les troubles prénataux et pédiatriques d&#39;apparition sont les plus prêtent à ce modèle d&#39;expression transitoire. Bien idéal pour faire des écrans composés de grandes chimiques, l&#39;utilisation de mutants génétiques n&#39;est pas possible pour le test systématique de milliers de variantes non synonymes qui contribuent à, et continuent d&#39;être détectés dans les troubles pédiatriques. Les tests de complémentation décrites ici profiter de cette docilité expérimental, un haut degré d&#39;homologie, et la préservation de la fonction entre les protéines humaines et le poisson zèbre, particulièrement pour les molécules nécessaires pour les processus de développement conservées. Figure 1 présente le test et la stratégie d&#39;identification des divers effets des allèles. Tant la perte de fonction (LOF) et des dosages dominantes peuvent être réalisées. Pour LOF, l&#39;expérience commence avec la suppression du gène d&#39;intérêt avec un knockdown morpholino, et dosage de phénotypes qui pourraient être pertinents pour le phénotype clinique sous enquête. Suppression peut être réalisée soit par blocage de la traduction en ciblant un MO à ou près du site d&#39;initiation de traduction du poisson zèbre locus (traduction bloquant morpholino; TBMO) ou par interférence avec l&#39;épissage en plaçant un MO sur une jonction d&#39;épissage, ce qui induit généralement soit l&#39;inscription d&#39;une intron ou exon aberrante à sauter (épissure blocage morpholino; SBMO). Par la suite, l&#39;ARNm coiffé de la transcription humain orthologue est introduit et quantifiable sauvetage du phénotype est mesurée. Une fois que le test est établie, les mutations candidats dans le message humain peuvent être introduits et testés pour leur capacité à sauver le phénotype MO-induite à la même efficacité que WT ARNm humain. En revanche, pour le candidat allèles dominants, l&#39;ARNm de l&#39;homme (mais pas MO) est introed avec une attente que l&#39;ARNm humain WT ne sera pas affecter gravement l&#39;anatomie et la physiologie du poisson zèbre, alors que l&#39;introduction de mutations de test qui ont un effet dominant va induire des phénotypes analogues à ceux observés dans l&#39;état clinique humaine. Cette expérience peut être fine davantage de disséquer si l&#39;effet dominant se fait par un gain de fonction (GOF) ou un mécanisme dominant négatif en mélangeant ARNm humain WT et mutant, pour les événements GOF, l&#39;ajout d&#39;ARNm humain WT devrait être pertinent, tandis que pour les allèles dominants négatifs, mélangeant de l&#39;ARNm WT et mutant devrait modifier la sévérité du phénotype mutant induit par un message. Dans tous les cas, nous recommandons que toutes les combinaisons d&#39;injections (MO avec WT ARNm humain vs morpholino avec mutant ARNm humain etc s&#39;effectuer, de préférence dans le même embrayage d&#39;embryons (voir Figure 1) L&#39;interprétation est comme suit.: Pour les tests LOF: <ul><li> Si le knockdownproduit un phénotype qui peut être sauvé de façon équivalente par l&#39;ARNm mutant et WT, l&#39;allèle est probablement bénigne. </li><li> Si le sauvetage mutant du phénotype knockdown est indiscernable de la phénotype knockdown lui-même, l&#39;allèle est un nul fonctionnel probable. L&#39;expérience ne peut pas distinguer entre les vraies valeurs nulles (aucune protéine fonctionnelle) et les niveaux d&#39;activité de protéines ultra-basse qui n&#39;ont pas la capacité de sauvetage. </li><li> Si le sauvetage mutant du phénotype knockdown est statistiquement meilleure que la MO, mais pire que le WT, l&#39;allèle est probablement un hypomorph que ce résultat démontre la perte partielle de la fonction. </li></ul> Pour les tests dominantes: <ul><li> S&#39;il n&#39;ya pas de phénotype knockdown, mais l&#39;injection de l&#39;ARNm WT produit un phénotype, un plan d&#39;urgence doit être utilisée si l&#39;expérience est de procéder (voir ci-dessous). </li><li> S&#39;il n&#39;ya pas de phénotype knockdown et l&#39;injection de l&#39;ARNm WT ne produit pas de phénotype, l&#39;expérience se déroule comme d&#39;habitude. </li><li> Si injectionl&#39;ARNm mutant est équivalente à celle de l&#39;ARNm de type sauvage, de l&#39;allèle peut être bénignes ou la perte de fonction, ou le dosage peut être défaillant. Cela nécessite une expérimentation plus poussée de discriminer entre ces options. </li><li> Si l&#39;injection d&#39;ARNm mutant est indiscernable de la MO knockdown, la fonction du produit du gène est probablement altéré en quelque sorte. Pour distinguer le changement de fonction, d&#39;un titrage de l&#39;ARNm mutant avec l&#39;ARNm de type sauvage ne doit être effectuée. </li><li> Si le résultat de ce titrage est indiscernable de type sauvage ARNm seul, il a été démontré que le produit de la protéine mutante utilise la protéine de type sauvage comme un substrat, comme son effet varie avec la quantité de titration. Cela indique un phénotype négatif dominant. </li><li> Si le résultat de ce titrage est indiscernable à l&#39;ARNm mutant seul, il a été démontré que le produit de la protéine mutante n&#39;a plus la même fonction que le type sauvage, et donc n&#39;est pas affecté par la quantité de type sauvage avant de produit protéiqueenvoyé. Cela démontre que l&#39;allèle est le gain probable de fonction. </li></ul> Plan d&#39;urgence: <ul><li> Si aucun phénotype présente de MO knockdown, mais ne présente avec l&#39;ARNm WT, une expérimentation plus poussée peut se produire, mais nous insistons sur le fait que cette situation n&#39;est pas idéale. ARNm humain HT doit être adaptée pour minimiser le phénotype, et peut également être utilisé en tant que nouvelle valeur de consigne. En outre coinjection de WT et ARNm humain mutant peut être évaluée en fonction de la capacité de sauvetage du mutant. </li></ul>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530S, M0530L </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DpnI restriction endonuclease</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0176L, R0176S </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Max Efficiency DH5&alpha; competent cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18258-012 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Big Dye Terminator</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4337455</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE Kit </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340, AM1344, AM1348</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td >Morpholino</td>
			<td>Gene-Tools</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td >1-phenyl-2-thiourea (PTU) </td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Prepare as 0.003% PTU in embryo media </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148 </td>
			<td>For embryos that must be fixed prior to phenotyping, prepare as 4%</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td >Tricaine methane sulfonate</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>N/A </td>
			<td>For anesthetization and euthanasia </td>
		 </tr>
 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PTC-225 Tetrad Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>Any equivalent thermal cycler</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nano Drop 2000 spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SMZ 745T Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>AZ100 Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DS Fi1 Digital Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>For color/fluorescent imaging</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DS QiMC Digital Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>For black/white imaging</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Advanced Resarch 3.2 Imaging Software</td>
			<td>NIS- Elements</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

in vivo modeling of the morbid human genome using danio rerio

Ici, nous présentons les méthodes pour le développement de tests pour interroger des changements non synonymes potentiellement cliniquement significatives à l&#39;aide de complémentation in vivo chez le poisson zèbre. Le poisson zèbre (Danio rerio) sont un système animal utile en raison de leur docilité expérimentale; embryons sont transparents pour permettre la visualisation facile, subir ex développement rapide vivo, et peuvent être manipulées génétiquement 1 Ces aspects ont permis des avancées significatives dans l&#39;analyse de l&#39;embryogenèse. processus moléculaires et signalisation morphogénétique. Pris ensemble, les avantages de ce modèle vertébré font poisson zèbre prête très bien à la modélisation des défauts de développement dans les maladies pédiatriques, et dans certains cas, des troubles adulte. Parce que le génome du poisson zèbre est hautement conservée avec celle des humains (~ 70% orthologue), il est possible de récapituler les états de maladies humaines chez le poisson zèbre. Ceci est réalisé soit par l&#39;injection de mutant m humaineARN à induire une prise dominant négatif ou d&#39;allèles de fonction, ou l&#39;utilisation de morpholino (MO) des oligonucléotides antisens pour supprimer les gènes d&#39;imiter la perte de variantes de fonction. Grâce à la complémentarité des phénotypes MO-induite avec l&#39;ARNm humain plafonné, notre approche permet à l&#39;interprétation de l&#39;effet délétère des mutations sur la séquence de la protéine humaine basée sur la capacité de l&#39;ARNm mutant pour sauver un mesurable, phénotype physiologiquement pertinents. Modélisation des allèles humains de la maladie se fait par micro-injection d&#39;embryons de poisson zèbre avec MO et / ou de l&#39;ARNm humain au stade de cellules 1-4 et phénotypage jusqu&#39;à sept jours après la fécondation (DPF). Cette stratégie générale peut être étendue à une large gamme de phénotypes de la maladie, comme le montre le protocole suivant. Nous présentons nos modèles établis pour la signalisation morphogénétique, l&#39;intégrité craniofaciale, cardiaques, vasculaires, la fonction rénale et squelettiques phénotypes des troubles musculaires, ainsi que d&#39;autres.

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In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Ici, nous présentons une approche systématique de développement physiologiquement pertinente, sensible et spécifique<em&gt; In vivo</em&gt; Tests pour interpréter la variation en pathologie humaine. Manipulation génétique transitoire par microinjection d&#39;ARNm humain WT et mutant et morpholino (MO) des oligonucléotides antisens exploiter la traçabilité du poisson-zèbre développement embryon rapidement mutations d&#39;analyse de pathogènes, en particulier, mais pas exclusivement, dans le contexte des troubles du développement humain.

In Vivo modélisation du génome humain morbide utilisant Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

20.5K vues.  Duke University Medical Center. Ici, nous présentons une approche systématique de développement physiologiquement pertinente, sensible et spécifique In vivo Tests pour interpréter la variation en pathologie humaine. Manipulation génétique transitoire par microinjection d'ARNm humain WT et mutant et morpholino (MO) des oligonucléotides antisens exploiter la traçabilité du poisson-zèbre développement embryon rapidement mutations d'analyse de pathogènes, en particulier, ...

Vidéo: In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Dissection fine et globale de l&#39;épithélium sensoriel de l&#39;oreille interne adultes poisson zèbre ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Recherche

Biologie

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Purification cytométrie en flux des cellules de souris méiotique

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

Dissection du cœur chez les larves, le poisson zèbre juvéniles et adultes, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and behavioural research. As a vertebrate, zebrafish share considerable genetic sequence similarity with humans and are being used as an animal model for various human disease conditions. The advantages of zebrafish in comparison to other common vertebrate models include high fecundity, low maintenance cost, transparent embryos, and rapid development. Due to the spur of interest in zebrafish research, the need to establish and maintain a productive zebrafish housing facility is also increasing. Although literature is available for the maintenance of a zebrafish laboratory, a concise video protocol is lacking. This video illustrates the protocol for regular housing, feeding, breeding and raising of zebrafish larvae. This process will help researchers to understand the natural behaviour and optimal conditions of zebrafish husbandry and hence troubleshoot experimental issues that originate from the fish husbandry conditions. This protocol will be of immense help to researchers planning to establish a zebrafish laboratory, and also to graduate students who are intending to use zebrafish as an animal model.

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

This protocol outlines regular maintenance and care to maintain optimal conditions for zebrafish husbandry. The video illustrates the protocol for system maintenance, regular housing, feeding, breeding, and raising of zebrafish larvae.

Soins et entretien réguliers d&#39;un poisson zèbre (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) Laboratoire: An Introduction

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

High Throughput<em&gt; Danio rerio</em&gt; Dépense énergétique Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

La cartographie du génome à l&#39;échelle du médicament-ADN interactions dans les cellules avec COSMIC (réticulation de petites molécules pour isoler la chromatine)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

Gap Junctional intercellulaire Communication: Un biomarqueur fonctionnelle pour évaluer les effets néfastes des substances toxiques et les toxines, et bienfaits pour la santé des produits naturels

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.

Etude in vivo de Human Interaction Endothelial-péricytes Utilisation du Gel Matrice Plug - test chez la souris

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Mesure de la rigidité de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Souris aortes Utiliser Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.