Ce travail a été soutenu par R01 DK078161 du NIDDK (LO), bourses de recherche postdoctorale de l&#39;American Heart Association (AB), les Fondations Wenner-Gren de la Suède et Kungliga Fysiografiska Sällskapet, Lund, Suède (UB). Un soutien additionnel a été fourni par le Maine Medical Center Research installations essentielles Institut pour l&#39;histopathologie, la bioinformatique et FACS (soutenu par 2P20RR18789-06) et l&#39;animalerie MMCRI.

1. La préparation de réactifs pour la digestion rein <ol><li> 1,5 ml de collagénase 0,25% A (p / v) et 1% Pancréatine digérer (w / v) sera nécessaire pour l&#39;extraction des cellules de zone néphrogénique (NZCS) à partir de 8 E17.5 reins. Parce Pancréatine dure environ 2 heures pour dissoudre à la température ambiante, assez condensé solution pour le plus grand nombre de reins embryonnaires attendus doivent être réalisés avant l&#39;expérience. Préparer digérer solution en ajoutant d&#39;abord 25 mg de collagénase A à 10 ml de phosphate de Dulbecco saline tamponnée (DPBS) dans un clair 15 ml, tube à centrifuger stérile. Il est essentiel que le DPBS ne contient pas de calcium ou de magnésium car cela va interférer avec la digestion enzymatique. Mélanger une solution sur un nutator pendant 10 minutes afin de dissoudre la collagénase A. Ajouter 100 mg de pancréatine à la collagénase dissous une solution et mélanger sur un nutator pendant au moins 2 heures. Alternativement, la collagénase A / Pancréatine digérer solution peut être mélangée sur un nutator nuit à 4 ° C. Il est recommandé de porter un masque, comme la collagénase A et pancréatine se dispersent facilement dans l&#39;atmosphère lors de la pesée et peut irriter les voies nasales. </li><li> Préparer un 5% de sérum bovin fœtal (FBS) (v / v) dans de Hank solution saline tamponnée (HBSS). Renverser pour mélanger. 1 ml pour chaque tube de 8 reins seront nécessaires. </li><li> Préparer un milieu de culture des kératinocytes en complétant milieu sans sérum avec de la glutamine à 1% (v / v) et 1% de pénicilline-streptomycine (Penstrep) (v / v). </li><li> Manteau stériles à fond plat des plaques de polystyrène de culture de tissu (96, 48, 24 ou 6 puits) avec une solution de fibronectine humaine à une concentration de 5 mg par cm 2 de surface de croissance. 5 mg de poudre de fibronectine est remis en suspension dans 5 ml de H 2 O. stériles Ceci est diluée dans du DPBS 01:25 stériles sans calcium ni magnésium et 250 ml est ajouté à chaque puits d&#39;une plaque à 24 puits. Les plaques sont ensuite incubés avec une solution de fibronectine à la température ambiante pendant 1 heure, puis 1 heure à 4 ° C. Sinon, les plaques peuvent être incubés une nuit à 4 ° C. La solution est ensuite aspirée dans une hotte à flux laminaire avant l&#39;addition de milieu / cellules. </li></ol> 2. Reins dissection &amp; Capsules Suppression (effectué à température ambiante) <ol><li> À E17.5, le sacrifice de la mère à l&#39;aide d&#39;une procédure approuvée par vos soins des animaux et du Comité institutionnel utilisation, enlever l&#39;utérus, et le placer dans une boîte de Pétri contenant du DPBS avec le calcium et le magnésium. Sous un microscope à dissection, l&#39;utilisation des horlogers pince pour retirer chaque embryon de l&#39;utérus et décapitent chaque embryon. Une fois la litière est entièrement hors de l&#39;utérus, le transfert des embryons à un plat propre de Pétri contenant du DPBS suffisamment de calcium et de magnésium pour couvrir entièrement les embryons laissant derrière autant de sang et de débris de tissu que possible. </li><li> En utilisant des pinces, faire une incision circulaire dans la paroi abdominale de l&#39;embryon au niveau de l&#39;ombilic. Ensuite, placez l&#39;embryon sur son dos, il épingler au niveau des épaules avec un jeu de pinces, et enlever les organes internes des poumons vers le bas de la vessie à l&#39;aide l&#39;autre jeu de pinces. Avec la pratique cela peut être fait en un seul mouvement. Les reins doivent être attachés à l&#39;arrière de la masse des organes. Si les reins ne restent pas attachés à des organes éviscérés, ils peuvent être soigneusement retiré de la paroi dorsale du corps. Reins qui ont été endommagés au cours de ce processus de dissection doivent être jetés car ils contaminer la culture finale avec les types de cellules inappropriée. </li><li> Doucement taquiner loin les reins du reste des organes, en prenant soin de maintenir les reins reliés les uns aux autres. Tenez le tissu entre les reins avec un jeu de pinces et de saisir la glande surrénale attaché à l&#39;un des reins avec la pince d&#39;autres. La glande surrénale doit être attaché à la capsule du rein. Décoller doucement la glande surrénale et de la capsule loin autour de l&#39;extérieur du rein, similaire à éplucher une banane. Prenez soin de ne pas diviser le rein de moitié pendant l&#39;épluchage, et être sûr de ne pas endommager le tissu rénal sous la capsule. Retirez délicatement la capsule restante ainsi que l&#39;uretère si elle est encore attaché. Répéter avec le rein restant. </li><li> Utiliser une pipette de transfert coupées de placer les reins dans un tube en polystyrène de 5 ml de HBSS. Répétez les étapes 02.02 à 02.04, pour chaque embryon. Les reins peuvent être regroupées 8 par tube. Avec l&#39;élimination pratique, la dissection et la capsule se prendre 2-3 minutes par embryon. </li></ol> 3. Digestion enzymatique des reins (toutes les étapes à température ambiante sauf indication contraire) <ol><li> Retirer solution HBSS de 5 ml contenant les tubes des reins avec une pipette tout en évitant soigneusement le contact avec les reins. Immédiatement ajouter 1,5 ml de collagénase A / Pancréatine digérer solution au tube de 5 ml contenant reins avant de passer à l&#39;échantillon suivant. Répétez l&#39;opération pour chaque tube de reins. </li><li> Placer les tubes avec l&#39;enzyme / reins digère sur un nutator dans un pré-chauffé 37 incubateur ° C pendant 15 minutes. 2 minutes avantachèvement de la digestion, ajouter 3 ul de DNase (1 U / ml) à un tube de polystyrène frais 5 ml pour chaque méthode de digestion en cours d&#39;exécution. </li><li> Enlever rapidement les digère de l&#39;incubateur, ajouter 75 ul de FBS et inverser 3 fois pour mélanger. Laisser reposer sur le banc pour 2 minutes. </li><li> Transfert de 1,4 ml de la suspension cellulaire sur le tube de polystyrène de 5 ml contenant la DNase (1 U / ml) tout en laissant le reste 0,2 ml de suspension cellulaire et les reins en arrière. Le supplément de 0,2 mL de la solution sera laissé derrière contenir des impuretés telles que la matrice extracellulaire. </li><li> Suspension cellulaire Mix / DNase sur un nutator dans un 37 pré-chauffé ° C incubateur pendant 10 minutes. </li><li> Enlever rapidement les suspensions cellulaires de l&#39;incubateur et le transfert de chaque à un tube Eppendorf de 1,5 ml. Spin suspensions cellulaires dans microcentrifugeuse à 325 g pendant 5 minutes. </li><li> Retirer le surnageant de culot cellulaire et remettre le culot dans 1 ml de 5% de FBS / HBSS, aspiration et refoulement 5 à 6 fois. Cap chaque tube avant de passer à l&#39;échantillon suivant. </li><li> Spin suspensions cellulaires dans une microcentrifugeuse à 325 g pendant 5 minutes. </li><li> Retirer le surnageant et ajouter 0,5 ml de kératinocytes milieu sans sérum (KSFM) avec des additifs pour chaque tube et le tube de la PAC avant de passer à l&#39;échantillon suivant. Après support a été ajouté à tous les tubes, doucement resuspendre chaque culot cellulaire par aspiration et une baisse de 5 à 6 fois avec une micropipette 1ml. Combiner tous les suspensions de cellules dans un tube de polystyrène frais 5 ml. </li><li> Pré-humides deux cellules de 40 microns-crépine bouchons placés sur un tube de 5 ml en polystyrène inférieure ronde avec KSFM par échantillon. Passe suspensions cellulaires à travers un bouchon tamis cellulaire en transférant avec une micropipette 1 ml. Évitez de toucher le filtre avec la pointe de la pipette. Recueillir accréditives et répétez la filtration à travers le bouchon crépine secondes. Retirez le bouchon filtre cellulaire et la remplacer par une nouvelle PAC à partir d&#39;un tube de polystyrène normal 5 ml. </li><li> Compter les cellules avec un hémocytomètre ou autre cellule dispositif de comptage et de cellules de transfert à des puits d&#39;une plaque de culture revêtues de fibronectine à une densité de 100.000-200.000 cellules par cm 2, diluer au besoin avec des KSFM avec des additifs. Généralement, nous récupérons environ 4.5x10 6 cellules par 10 litières embryon. </li><li> Incuber les cellules dans un 37 ° C incubateur humidifié avec 5% de CO 2. </li><li> Laisser les cellules de récupérer et de joindre pour 2-4 heures en moyenne avant la stimulation avec des réactifs supplémentaires. Stimuler les cellules avec un composé d&#39;intérêt de 1 à 48 heures. Purifier l&#39;ARN pour l&#39;analyse PCR en utilisant le kit Qiagen RNeasy Micro suivant les instructions du fabricant ou suivez les instructions ci-dessous pour fluorescence immunocoloration des cellules. </li></ol> 4. La préparation de réactifs pour la fixation des cellules et Immunocoloration <ol><li> Préparer 4% PFA: Dissoudre 4% de paraformaldéhyde dans du PBS (v / v) à 55 ° C avec agitation régulière. Laisser refroidir à température ambiante avant utilisation. Cette solution est toxique et doit être jeté dans des conteneurs des déchets désignés. </li><li> Préparer la solution de perméabilisation en ajoutant Triton X-100 à PBS pour obtenir une solution de 0,3% (v / v). </li><li> Préparer une solution à 5% de blocage en PBS avec du sérum de la même espèce que celle utilisée pour élever l&#39;anticorps secondaire à être utilisé. Par exemple, si vous voulez détecter un anticorps de lapin contre votre antigène cible avec un âne anti-lapin Alexa Fluor 568, préparer une solution de blocage contenant du sérum d&#39;âne de 5%. Conserver à 4 ° C. </li><li> Préparer la solution d&#39;anticorps primaire par l&#39;ajout de la concentration appropriée d&#39;anticorps à la solution de blocage de 5%. </li><li> Préparer une solution d&#39;anticorps secondaire immédiatement avant l&#39;utilisation. Ajouter anticorps fluorophore conjugué à la concentration recommandée par le fabricant en collaboration avec l&#39;industrie nucléaire au DAPI Counterstain et d&#39;autres marqueurs tels que organite phalloïdine à la solution de 5% de blocage. Si le stockage est nécessaire, garder solution dans l&#39;obscurité à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Préparer glycérol à 50% / solution de PBS (v / v) pour le stockage de cellules immunocolorés. Alternativement, Vectashield peuvent être utilisés. </li></ol> 5. Fixation des cellules et Immunocoloration <ol><li> Le protocole suivant est destiné à la fixation et la coloration des NZCS dans une plaque à 24 puits. Les volumes sont donnés pour un seul puits. Les réactifs doivent être délicatement la pipette pendant toutes les étapes pour éviter le détachement des cellules, et l&#39;agitation plaque n&#39;est pas recommandé dans les étapes d&#39;incubation. </li><li> Retirer délicatement moyenne avec une micropipette de 1 ml et ajoutez 0,5 ml de 4% à la PFA attachés cellules cultivées. Incuber pendant 15 minutes à température ambiante non perturbée. </li><li> Retirer PFA 4% et ajouter 0,5 ml par puits d&#39;une solution de perméabilisation. Incuber 10 minutes à température ambiante. </li><li> Retirer solution de perméabilisation et rincer doucement à deux reprises avec 0,5 ml de PBS par rinçage. </li><li> Ajouter 0,5 ml de solution de blocage et incuber à température ambiante pendant 60 minutes. </li><li> Retirer la solution de blocage et ajouter 0,225 ml de solution d&#39;anticorps primaire. </li><li> Incuber à température ambiante pendant 2 heures ou toute la nuit à 4 ° C. </li><li> Retirer solution d&#39;anticorps primaire et doucement rinse à deux reprises avec 0,5 ml de PBS par rinçage. </li><li> Ajouter 0,225 ml de solution d&#39;anticorps secondaire. Incuber la plaque dans l&#39;obscurité à température ambiante pendant 60 minutes. </li><li> Retirer solution d&#39;anticorps secondaire et rincer doucement à deux reprises avec 0,5 ml de PBS par rinçage. </li><li> Ajouter 0,3 ml de glycérol à 50% / PBS solution (v / v) ou Vectashield suffisante pour couvrir le fond du puits de surface. </li><li> Cellules d&#39;image avec microscope à épifluorescence ou stocker enveloppés dans une feuille à 4 ° C. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2555/2555fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. NZCS ont été purifiés à partir de E17.5 embryons, plaquées à 200 000 cellules par cm 2 et incubées à 37 ° C pour un total de 24 heures. Les cellules ont été imagés par contraste de phase avec un microscope Leica DM IRB inversé avant coloration par immunofluorescence. (A) 20X vue contraste de phase de NZCS après 24 heures dans la culture. (B) Les cellules ont été fixées et colorées avec un anticorps de lapin anti-PAX2 anticorps spécifique pour les cellules progénitrices néphron (rouge) et un secondaire Alexa Fluor 568 ânes conjugué anti-lapin. Remarque noyaux bleus de contraste avec le DAPI. (C) vue 40x à contraste de phase d&#39;un cluster de progéniteurs néphron (centrée) après 24 heures de culture. (D) l&#39;image de la 40X NZCS isolée de LacZ + embryons de la souche Foxd1 LacZ, qui exprime β-galactosidase sous le contrôle du promoteur Foxd1. Foxd1 est exprimé dans la population de cellules stromales dans la zone néphrogénique du rein en développement. Les cellules ont été colorés avec la phalloïdine F-actine marqueur (Oregon Green primaires conjugués), le nucléaire au DAPI tache (bleu) et de lapin anti-β-galactosidase (secondaire - Alexa Fluor âne anti-lapin 568) pour la détection de cellules stromales Foxd1 + ( rouge).

<ol>
	<li>Blank, U., Brown, A., Adams, D. C., Karolak, M. J., Oxburgh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP7+promotes+proliferation+of+nephron+progenitor+cells+via+a+JNK-dependent+mechanism.">BMP7 promotes proliferation of nephron progenitor cells via a JNK-dependent mechanism.</a> Development. 136, 3557-3566 (2009).</li><li>Brunskill, E. W., Aronow, B. J., Georgas, K., Rumballe, B., Valerius, M. T., Aronow, J., Kaimal, V., Jegga, A. G., Grimmond, S., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+gene+expression+in+the+developing+kidney+at+microanatomic+resolution.">Atlas of gene expression in the developing kidney at microanatomic resolution.</a> Developmental Cell. 15, 781-791 (2008).</li><li>Godin, R. E., Takaesu, N. T., Robertson, E. J., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+BMP7+expression+during+kidney+development.">Regulation of BMP7 expression during kidney development.</a> Development. 125, 3473-3482 (1998).</li><li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inductive+epitheliomesenchymal+interaction+in+cultured+organ+rudiments+of+the+mouse.">Inductive epitheliomesenchymal interaction in cultured organ rudiments of the mouse.</a> Science. 118, 52-55 (1953).</li><li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+interaction+between+embryonic+mouse+tissues+separated+by+a+membrane+filter.">Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter.</a> Nature. 172, 869-870 (1953).</li><li>Hatini, V., Huh, S. O., Herzlinger, D., Soares, V. C., Lai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+stromal+mesenchyme+in+kidney+morphogenesis+revealed+by+targeted+disruption+of+Winged+Helix+transcription+factor+BF-2.">Essential role of stromal mesenchyme in kidney morphogenesis revealed by targeted disruption of Winged Helix transcription factor BF-2.</a> Genes and Development. 10, 1467-1478 (1996).</li><li>Oxburgh, L., Chu, G. C., Michael, S. K., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFb+superfamily+signals+are+required+for+morphogenesis+of+the+kidney+mesenchyme+progenitor+population.">TGFb superfamily signals are required for morphogenesis of the kidney mesenchyme progenitor population.</a> Development. 131, 4593-4605 (2004).</li><li>Srinivas, S., Watanabe, T., Lin, C. S., William, C. M., Tanabe, Y., Jessell, T. M., Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1, 4-4 (2001).</li><li>Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+proliferation+and+differentiation+of+mesenchymal+cells+in+the+mouse+metanephric+kidney.">Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney.</a> Development. 129, 5301-5312 (2002).</li></ol>

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour isoler et cultiver les cellules de la zone néphrogénique du rein embryonnaire. Il est le développement d&#39;une méthode initialement publié dans le cadre d&#39;une étude sur les effets des traitements sur les cellules BMP7 de la zone néphrogénique (Blank et al., 2009). Dans l&#39;étude initiale, une série d&#39;expériences visant à caractériser les types de cellules représentées au sein de la population NZC ont été menées. Brièvement, la p...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Watchmaker&#x2019;s forceps #5</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-4905</td>
<td>2 pairs required</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>10 103 578 001</td>
<td>Wear mask</td>
</tr>
<tr>
<td>Porcine Pancreatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P8096</td>
<td>Wear mask</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS w/ Ca, Mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-513F</td>
<td>With Mg &amp; Ca</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioWhittaker</td>
<td>14-901E</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14175</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KSFM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>10724-011</td>
<td>without added growth factors</td>
</tr>
<tr>
<td>L-Glutamine 200mM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7513</td>
<td>Use @ 1% v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4333</td>
<td>Use @ 1% v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>356008</td>
<td>Supplied as powder</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well culture plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific </td>
<td>142485</td>
<td>Nunclon</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS w/o Mg &amp; Ca</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-512F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5mL polystyrene tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352235</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNase (1 U/&mu;l)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18068-015</td>
<td>4 &mu;l per 1.5 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>40 micron cell-strainer </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352235</td>
<td>w/cap and tube</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>Use @ 4 % w/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>VW3929-2</td>
<td>Use @ 0.3 % v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P3813</td>
<td>Supplied as powder</td>
</tr>
<tr>
<td>Donkey serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>017-000-121</td>
<td> Use @ 5 % v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit anti-PAX2 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>71-6000</td>
<td>Dilute 1:100</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit anti-&beta;-gal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedicals</td>
<td>559762</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Oregon Green 488 phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>O7466</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A10042</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D1306</td>
<td>Dilute 1:5000</td>
</tr>
<tr>
<td>Vectashield</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>GX0185-6</td>
<td>Mix 50 % with H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>RNeasy Micro Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74004</td>
<td>Use "DNase on column" protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>Transfer pipettes, 3ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>357575</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and culture of cells from the nephrogenic zone of the embryonic mouse kidney

Le développement embryonnaire du rein a été largement étudié à la fois comme un modèle pour l&#39;interaction épithélio-mésenchymateuse dans l&#39;organogénèse et d&#39;acquérir la compréhension des origines de la maladie rénale congénitale. Plus récemment, la possibilité de piloter naïve cellules souches embryonnaires vers des destins néphrogénique a été explorée dans le domaine émergent de la médecine régénérative. Des études génétiques chez la souris ont identifié plusieurs voies nécessaires pour le développement du rein, et un catalogue global de la transcription du gène dans l&#39;organe a été récemment générées <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a> , offrant de nombreux régulateurs candidat des fonctions essentielles de développement. L&#39;organogenèse du rein chez les rongeurs peuvent être étudiés en culture d&#39;organe, et de nombreux rapports ont utilisé cette approche pour analyser les résultats des deux protéines appliquant candidat ou faire tomber l&#39;expression de gènes candidats en utilisant siRNA ou morpholinos. Cependant, l&#39;applicabilité de la culture d&#39;organes pour l&#39;étude de la signalisation qui régule la tige / différenciation de cellules progénitrices de renouvellement par rapport au niveau du rein en développement est limité en tant qu&#39;organes de culture contenant une diffusion matrice compacte limitant extracellulaire des macromolécules et des particules virales. Pour étudier la signalisation cellulaire des événements qui influencent la tige / niche de cellules progénitrices dans les reins, nous avons développé un système de cellules primaires qui établit la zone néphrogénique ou une niche de cellules progénitrices de l&#39;ex vivo du rein en développement dans l&#39;isolement de l&#39;inducteur de la différenciation épithéliale. En utilisant la digestion enzymatique limitée, les cellules de zone néphrogénique peut être sélectivement libérée de développer reins à E17.5. Après filtration, ces cellules peuvent être cultivées comme une monocouche irrégulière en utilisant des conditions optimisées. L&#39;analyse du gène marqueur démontre que ces cultures contiennent une distribution des types cellulaires caractéristiques de la zone néphrogénique in vivo, et qu&#39;ils maintiennent l&#39;expression du gène marqueur approprié pendant la période de culture. Ces cellules sont très accessibles à de petites molécules et le traitement de protéines recombinantes, et surtout aussi à la transduction virale, ce qui facilite grandement l&#39;étude de la candidate souches / progéniteurs effets régulateur de la cellule. Paramètres biologiques de base cellulaires comme la prolifération et mort cellulaire ainsi que des changements dans l&#39;expression des marqueurs moléculaires caractéristiques de néphrons cellules souches / progénitrices in vivo peuvent être utilisés avec succès comme les résultats expérimentaux. Les travaux en cours dans notre laboratoire en utilisant cette technique de cellules primaires roman vise à découvrir les mécanismes de base régissant la réglementation de l&#39;auto-renouvellement versus différenciation dans les néphrons cellules souches / progénitrices.

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Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Dans ce rapport, nous décrivons une méthode pour l&#39;isolement et la culture de la niche de cellules progénitrices du rein d&#39;embryon de souris qui peuvent être utilisées pour étudier les voies de signalisation réglementant cellules souches / progénitrices du rein en développement. Ces cellules cultivées sont très accessibles à de petites molécules et le traitement de protéines recombinantes, et surtout aussi à la transduction virale, ce qui permet une manipulation efficace des voies candidat.

Isolement et culture de cellules de la zone néphrogénique du rein d&#39;embryon de souris

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

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Research

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Biology

17.9K vues.  Maine Medical Center Research Institute. Dans ce rapport, nous décrivons une méthode pour l'isolement et la culture de la niche de cellules progénitrices du rein d'embryon de souris qui peuvent être utilisées pour étudier les voies de signalisation réglementant cellules souches / progénitrices du rein en développement. Ces cellules cultivées sont très accessibles à de petites molécules et le traitement de protéines recombinantes, et surtout aussi à la transduction virale, ce qui permet une...

Vidéo: Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

L&#39;isolement et la dérivation de cellules germinales embryonnaires de souris

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

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Biologie

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

Isolement et culture de cellules progénitrices embryonnaires aviaires valvulaire

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

L&#39;isolement des cellules souches rétiniennes de l&#39;Oeil de la souris

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Génération de souris dérivées de cellules souches pluripotentes induites

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolement et culture des cellules souches épithéliales dentaire de l&#39;adulte de souris Incisive

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

Protein Isolation du développement embryonnaire Souris Coeur Région Valve

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

L&#39;isolement et la culture primaire de cellules endothéliales aortiques de souris

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

TRANS-intérieur cellulaire massive Injection de cellules souches embryonnaires conduit à des taux plus élevés de chimérisme

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

Isolement et culture simultanés des myocytes auriculaires, des myocytes ventriculaires et des non-myocytes provenant d’un cœur de souris adulte

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of the cells. These adjustments are critical to eukaryotic cell survivability and &#39;damage control&#39; during fluctuating nutrient and salinity levels, temperature, and various chemical and radiation stresses. Due to the highly dynamic nature of the RNA-level responses, and the instability of many of the RNA:RNA and RNA:protein intermediates, obtaining a meaningful snapshot of the cytoplasmic RNA state is only possible with a limited number of methods. Transcriptome-wide, RNA-seq-based ribosome profiling-type experiments are among the most informative sources of data for the control of translation. However, absence of a uniform RNA and RNA:protein intermediate stabilization can lead to different biases, particularly in the fast-paced cellular response pathways. In this article, we provide a detailed protocol of rapid fixation applicable to eukaryotic cells of different permeability, to aid in RNA and RNA:protein intermediate stabilization. We further provide examples of isolation of the stabilized RNA:protein complexes based on their co-sedimentation with ribosomal and poly(ribo)somal fractions. The separated stabilized material can be subsequently used as part of ribosome profiling-type experiments, such as in Translation Complex Profile sequencing (TCP-seq) approach and its derivatives. Versatility of the TCP-seq-style methods has now been demonstrated by the applications in a variety of organisms and cell types. The stabilized complexes can also be additionally affinity-purified and imaged using electron microscopy, separated into different poly(ribo)somal fractions and subjected to RNA sequencing, owing to the ease of the crosslink reversal. Therefore, methods based on snap-chilling and formaldehyde fixation, followed by the sedimentation-based or other type of RNA:protein complex enrichment, can be of particular interest in investigating finer details of rapid RNA:protein complex dynamics in live cells.

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

We present a technique to rapidly stabilize translational (protein biosynthesis) complexes with formaldehyde crosslinking in live yeast and mammalian cells. The approach enables dissecting transient intermediates and dynamic RNA:protein interactions. The crosslinked complexes can be used in multiple downstream applications such as in deep sequencing-based profiling methods, microscopy, and mass-spectrometry.

Fixation et isolement rapides in vivo de complexes translationnels à partir de cellules eucaryotes

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...