1. Fixation des échantillons et résine d&#39;enrobage <ol><li> Des échantillons de tissus frais et les cellules sont fixés pour au moins 2 heures dans du paraformaldéhyde à 2%, et 2,5% de glutaraldéhyde dans du tampon phosphate 0,1 M à un pH de 7,4. La taille de l&#39;échantillon ne doit pas dépasser 0,150 mm d&#39;épaisseur pour permettre une pénétration adéquate ou fixateur, et ne doit pas être laissé dans le correctif pour plus de 12 heures. </li><li> Placer les échantillons dans des flacons de 20ml à scintillation en verre et rincez-les trois fois, 5 minutes chacun, dans 0,1 M de tampon cacodylate. </li><li> Colorer à 1,5% (p / v) de potassium tétroxyde d&#39;osmium ferrocyanure et 1% (p / v) dans 0,1 M de tampon cacodylate (0,1 M, pH 7,4) pendant 30 minutes. </li><li> Tache avec du tétroxyde d&#39;osmium 1,0% (p / v) en tampon cacodylate 0,1 M pendant 30 minutes. </li><li> Rincer une fois avec de l&#39;eau distillée double pour 3 minutes. </li><li> Colorer à 1% (p / v) d&#39;acétate d&#39;uranyle dans l&#39;eau bidistillée pour 30 minutes. </li><li> Rincer les sections pendant 5 minutes dans de l&#39;eau bidistillée, puis se déshydrater en série graduée d&#39;alcool, à 2 min de chaque changement (1 x 50%, 1 x 70%, 1 x 90%, 1 x 95%, 2 x 100%). </li><li> Intégrer dans des concentrations croissantes de résine mélangée à l&#39;éthanol Durcupan, à 30 minutes chaque changement, à partir de Durcupan 50% dans l&#39;éthanol, puis suivi par: 70%, 90%, 95%, puis à 100%. </li><li> Remplacez-le par Durcupan frais et agiter doucement pendant 4 heures. </li><li> Sections Place, en utilisant des bâtons cocktail de bois, sur des microscopes lames de verre recouvertes avec l&#39;agent de la moisissure se séparer, et le placer dans le four à 65 ° C pendant 24 heures. </li></ol> 2. Préparation de l&#39;échantillon pour le FIB / SEM <ol start="11"><li> Séparez la couche de résine, contenant les échantillons, de l&#39;entre deux lames de microscope en verre et se laver soigneusement pour enlever toute moisissure agent de séparation. </li><li> En utilisant un microscope à lumière transmise avec les objectifs de faible puissance, ou loupe binoculaire avec éclairage transmis, pour identifier la région d&#39;intérêt dans la tranche de la résine. </li><li> Coupez un petit (3 mm x 3 mm) carrés autour de la région d&#39;intérêt en utilisant une lame de rasoir et coller ce au sommet du bloc de résine vierge avec de la colle acrylique (figure 1). Attendez 5 minutes pour que la colle durcisse, puis passez à l&#39;étape suivante. </li><li> Fixer le bloc dans le titulaire de la ulramicrotome et, en utilisant le stéréomicroscope attachés, bordure autour de la région d&#39;intérêt avec une lame de rasoir jusqu&#39;à ce que seul une petite pyramide de vestiges matériels. </li><li> D&#39;autres garnitures du bloc, en utilisant un couteau dans le verre fixe ultramicrotome, de sorte que la région d&#39;intérêt peut être situé précisément en ce qui concerne les dimensions de la surface du bloc (figure 1). Couper un bord du bloc, à proximité de la région d&#39;intérêt, de sorte qu&#39;une étape perpendiculaire est coupé à travers l&#39;échantillon (figure 1 et 2). Cette étape constitue la face d&#39;imagerie (figure 2). </li><li> Retirez le bloc de la ultramicrotome et de photographier la région d&#39;intérêt au sein du bloc, en utilisant un microscope à lumière transmise. </li><li> Couper le bloc coupé loin du talon de résine restante. Ceci est fait en utilisant scie de bijoutier et assure que seul un petit bloc est placé à l&#39;intérieur du FIB / SEM. La hauteur totale de ce bloc ne doit pas être supérieur à 5 mm. </li><li> Collez le bloc d&#39;aluminium avec un talon pâte de carbone assurant que le côté à numériser est sur le bord extérieur (figure 1). </li><li> Après la colle séchée, recouvrir le bloc avec une fine couche d&#39;or (&gt; 20 nm; système d&#39;évaporation sous vide Cressington). </li></ol> 3. Imagerie dans la FIB / SEM <ol start="20"><li> A un faible grossissement, et en utilisant l&#39;imagerie d&#39;électrons secondaires (5 kV, 0,5 NAMP), orienter le bloc de sorte que la région choisie d&#39;intérêt et le côté du bloc à imager est confronté l&#39;opérateur (figure 2 c, d). </li><li> Orientez le bloc afin que le visage à imager est parallèle à la poutre de fraisage. Cela signifie que faisceau d&#39;électrons est orienté à 54 ° par rapport à cette face (figure 2 b). </li><li> En utilisant un faisceau d&#39;ions actuel de 13 à 27 à 30 kV Namps retirer une bande étroite de résine de l&#39;avant de la région à imager. </li><li> Passer en mode d&#39;imagerie rétrodiffusée pour voir la face fraisée qui recouvre la région d&#39;intérêt. </li><li> Utilisation de la microscopie optique d&#39;image de référence (prise à l&#39;étape 16) et l&#39;image du visage fraisé localiser la région exacte sur le bloc pour être broyé et imagées (Figure 2). </li><li> Dépôt d&#39;une couche protectrice (environ 1 micron d&#39;épaisseur) de carbone (ou en métal), en utilisant le système d&#39;injection de gaz du microscope, sur la surface du bloc, au-dessus de la région d&#39;intérêt (figure 2). </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un courant de 700 picoAmps, moulin finement la région du bloc dans lequel les images finales seront prises. </li><li> Laisser le faisceau mouture complètement moulin à ce visage image jusqu&#39;à pas d&#39;artefacts de fraisage peut être vu sur le visage. Un moulin complet du visage est vérifiée en observant les changements dans chaque image subséquentes à travers le champ de vision. Fraisage inadéquat peut également considéré comme des stries blanches ou «rideaux» figurant Vertically dans l&#39;image. </li><li> Laisser le microscope pendant au moins 2 heures pour tout changement thermique pour dissiper. Cela réduit le risque que la face du bloc va dériver pendant l&#39;imagerie, aboutissant à des images alignées. </li><li> Sélectionnez les paramètres de microscope pour l&#39;imagerie du visage en série. Assurez-vous que le faisceau d&#39;électrons a une tension qui est assez bas pour l&#39;image seule une très faible profondeur de matériel dans la face du bloc. Cela devrait également être beaucoup moins profonde que l&#39;épaisseur de la face pour être enlevé. Les paramètres typiques de l&#39;imagerie sont des tensions entre 1,2 à 2,0 kV avec des tailles de pixels compris entre 4 - 20 nm. Le pixel habitent besoin de temps pour être maintenu autour de 10 μsecs sorte que le temps total à l&#39;usine sur le visage et l&#39;acquisition d&#39;une image est maintenue en dessous de 2 minutes (figure 3). </li></ol> 4. Secrets de la réussite Étape 1) s&#39;assurer que les échantillons ne sont pas plus épais que 150 microns. Cela permettra une pénétration adéquate des taches différentes et de la résine dans le matériau. Ceci peut être réalisé en sectionnant les échantillons avec un vibratome immédiatement après la fixation. Cette épaisseur est appropriée pour le tissu cérébral. D&#39;autres tissus doivent être testés pour garantir une fixation adéquate et la coloration. Étape 3) Les échantillons doivent être distribuée gratuitement dans toute la solution, et non groupées dans une partie du flacon tout ce fixateur secondaire est introduit. Cela permettra d&#39;assurer une pénétration maximale de l&#39;échantillon et à réduire l&#39;échantillon devient déformée lors de ce processus de fixation. Ceci est réalisé en remuant doucement les échantillons dans le flacon immédiatement après que la solution est ajoutée. Étape 15) Assurez-vous que la région d&#39;intérêt est située immédiatement au-dessous (&lt;30 microns) de la surface du bloc. Cela permettra de réduire la quantité de mouture par le faisceau d&#39;ions pendant la phase d&#39;acquisition d&#39;image. Etape 22) Le temps de balayage du faisceau d&#39;ions doit être adequte pour s&#39;assurer que le visage entier, est complètement blanchi. Fraisage inadéquat sera affiché comme des stries blanches, ou «rideaux» figurant à la verticale sur le visage d&#39;imagerie. Etape 26) Le visage finale moulu doit être plus grand que le visage qui est imagé. C&#39;est parce que la résine broyée est éjecté du bloc et redépose sur la surface du bloc dans le voisinage immédiat. Cette redéposition peut empiéter sur le champ de vue de l&#39;imagerie, et est évité par fraisage d&#39;une zone beaucoup plus grande que ce qui est imagé. Pour une fenêtre d&#39;imagerie qui est de 20 microns de large, la face du bloc usiné est supérieure à 30 microns de large. Étape 29) Il est essentiel que les paramètres du faisceau d&#39;électrons est telle que l&#39;image est générée par des électrons qui émergent à partir de seulement les premiers nanomètres quelques de la surface du bloc. Cette une acheved en minimisant la tension en dessous de 2 kV et veiller à ce qu&#39;aucun électrons pénètrent trop loin. Ceci est aussi aidé par l&#39;utilisation d&#39;une tension de grille sur le détecteur de sorte que seul l&#39;électron avec les plus hautes énergies contribuent à l&#39;image finale. Typiquement, une tension de grille de 1,3 kV est utilisé pour une tension de 1,5 kV imagerie. 5. Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Préparation du bloc de résine. Une résine) embarqué coupe coronale (80 microns d&#39;épaisseur) grâce à un cerveau de rat adulte affiché dans un steromicroscope. L&#39;image montre clairement les différentes régions du cerveau qui peut être coupé de la section (b) en utilisant une lame de scalpel. Ici, un carré de 1 mm du cortex est retirée et (c) collé à un bloc de résine vierge. D) Le bloc de résine est ensuite ébarbé avec un couteau de verre monté dans un ultramicrotome, et une fois le bloc a été réduit à seulement quitter le région d&#39;intérêt (e), une étape est coupée perpendiculairement à la surface avant du matériel embarqué. f) Cette région entière taillée est alors coupé du reste de la résine et montée sur un talon en aluminium prête pour le revêtement de métal et de l&#39;imagerie dans le microscope électronique à balayage. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Préparation de la face du bloc pour FIB / SEM imagerie. A) et b) montrent les illustrations du bloc et le bord qui est moulu pour créer le visage d&#39;imagerie (indiquée avec le noir double flèche). La position du faisceau d&#39;ions (blanc) est indiqué parallèlement à la face d&#39;imagerie, et le faisceau d&#39;électrons (en gris) est montré frapper le visage à 54 ° au faisceau d&#39;ions. C) montre une vue du bloc de prise avec le faisceau d&#39;électrons et imagé avec les électrons secondaires. Le long de ce côté du bloc sombre une région (indiqué par boîte blanche pointillée) montre une partie du visage qui a été grossièrement moulu (illustré avec double têteed flèche noire) pour révéler l&#39;échantillon sous-jacent. d) Lorsque cette région est imagée en utilisant uniquement les électrons rétrodiffusés le tissu embarqué peut être vu. Ici, la largeur de la section de tissu incorporé est indiquée par une flèche à double tête blanche. La barre d&#39;échelle en C) est de 100 microns. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Imagerie du volume des tissus du cerveau avec les voxels isotropes. A) Inversion contraste de l&#39;image rétrodiffusée de la face du bloc montrant l&#39;ultrastructure dans une région du cerveau du rat. Toutes les membranes sont visibles ainsi que des structures macromoléculaires. B) Un total de 1600 images ont été recueillies à 5 nm d&#39;espacement résultant en une pile d&#39;images avec les voxels isotropes. C) Cette pile peut être captée dans n&#39;importe quel plan avec la même résolution. Cette image montre que la seule connexion synaptique est imagé dans le plan xy et le plan yz.

<ol>
	<li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling.">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> J Neurosci. 28, 2959-2964 (2008).</li><li>Hekking, L. H., Lebbink, M. N., De Winter, D. A., Schneijdenberg, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam-scanning+electron+microscope:+exploring+large+volumes+of+atherosclerotic+tissue.">Focused ion beam-scanning electron microscope: exploring large volumes of atherosclerotic tissue.</a> J Microsc. 235, 336-347 (2009).</li><li>Armer, H. E., Mariggi, G., Png, K. M., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+transient+blood+vessel+fusion+events+in+zebrafish+by+correlative+volume+electron+microscopy.">Imaging transient blood vessel fusion events in zebrafish by correlative volume electron microscopy.</a> PLoS One. 4, e7716-e7716 (2009).</li></ol>

La technique du FIB / SEM fonctionne de manière optimale lorsque la région d&#39;intérêt n&#39;est pas trop grand. La limite supérieure pour un volume imagé dépend du faisceau d&#39;ions et de la région qu&#39;elle peut constamment moulin à plusieurs reprises pendant plusieurs heures. Jusqu&#39;à présent, ce qui a été fait avec des zones d&#39;environ 60 x 60 microns, cependant, l&#39;imagerie de cette surface n&#39;est pas possible avec une résolution d&#39;image convenable, principalement en raison du facteur temps dans la collecte d&#39;une telle image de grande taille. À titre d&#39;exemple, une image 4 kx 4 k avec un pixel temporisation à 10 microsecondes prendrait 2 minutes et 40 secondes à acquérir, et pour un champ de vision de 60 microns cela ne ferait que donner une taille de pixel de 15 nm. Pour l&#39;imagerie de l&#39;ultrastructure des cellules et des tissus, une plus petite taille des pixels est plus approprié, généralement entre 4 et 10 nm / pixel. Pour une surface de 60 x 60 microns, l&#39;image serait acquise en 10 heures, même si le microscope avait cette capacité. Pour ces raisons, le microscope est un outil idéal pour des volumes de l&#39;image de l&#39;ordre de 10 x 10 x 10 microns, ou des régions importantes de cellules entières. Cela peut facilement être fait dans un délai de 48 heures sur des échantillons qui sont bien en contraste avec cette procédure. Jusqu&#39;ici le protocole a été utilisé principalement avec les tissus du cerveau, ainsi que différents types de cellules de mammifères cultivées adhérant à lamelles. Toutefois, la procédure de fixation et de coloration peut être utilisé avec de nombreux autres types de matériel biologique, y compris les matières végétales pour produire aussi des piles d&#39;images bien contrastées. Par conséquent, le principal avantage de cette technique est sa capacité à volumes d&#39;image avec les voxels isotropes. Piles d&#39;images de ce type permettent d&#39;analyser le volume 3D en utilisant des images prises à n&#39;importe quel plan dans la pile. L&#39;avantage de cela est de permettre à l&#39;observateur de caractéristiques de l&#39;image de la série d&#39;images de n&#39;importe quelle direction et en fournissant un détail plus grande image (figure 3).

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom de réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> Colle cyanoacrylate </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscope à dissection: Leica MZ8 </td><td> Leica Microsystems, Allemagne </td><td></td></tr><tr><td> Durcupan de résine </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Suisse </td><td></td></tr><tr><td> FIB / SEM microscope (Zeiss, Nvision 40) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Verre d&#39;histologie diapositives </td><td> Menzel-Glaser, Allemagne </td><td> AA00008032E </td></tr><tr><td> Coutelier de verre: Leica EM KMR2 </td><td> Leica Microsystems, Allemagne </td><td></td></tr><tr><td> Flacons à scintillation en verre (20ml) </td><td> EMS, USA </td><td> 72634 </td></tr><tr><td> Glutaraldéhyde </td><td> EMS, USA </td><td> 16222 </td></tr><tr><td> Joaillier vu </td><td> EMS, USA </td><td> 72010 </td></tr><tr><td> Agent de moisissure séparant </td><td> GLOREX, Suisse </td><td> 62407445 </td></tr><tr><td> Tétroxyde d&#39;osmium </td><td> EMS, USA </td><td> 19110 </td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde </td><td> EMS, USA </td><td> RT 19208 </td></tr><tr><td> Sels de phosphate pour un tampon phosphate </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Suisse </td><td> 71642 et 71496 </td></tr><tr><td> Cacodylate de sodium </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Suisse </td><td> 20840 </td></tr><tr><td> Sputter Coater avec l&#39;objectif d&#39;or </td><td> Cressington, USA </td><td></td></tr><tr><td> Tris base (TBS) </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Suisse </td><td> T1378 </td></tr><tr><td> Ultramicrotome: Leica UCT </td><td> Leica Microsystems, Allemagne </td><td></td></tr><tr><td> Acétate d&#39;uranyle </td><td> EMS, USA </td><td> RT 22451 </td></tr></tbody></table>

focussed ion beam milling and scanning electron microscopy of brain tissue

Ce protocole décrit comment échantillons biologiques, comme les tissus du cerveau, peut être imagée en trois dimensions à l&#39;aide du microscope ions porté par faisceau d&#39;électrons / balayage (FIB / SEM). Les échantillons sont fixés avec des aldéhydes, taché métaux lourds utilisant le tétroxyde d&#39;osmium et de l&#39;acétate d&#39;uranyle. Elles sont ensuite déshydratées avec de l&#39;alcool et infiltré avec de la résine, qui est ensuite durci. En utilisant un microscope optique et ultramicrotome avec des couteaux de verre, un petit bloc contenant l&#39;intérêt région proche de la surface est faite. Le bloc est ensuite placé à l&#39;intérieur du FIB / SEM, et le faisceau d&#39;ions utilisées pour environ moulin à une face verticale sur un côté du bloc, à proximité de cette région. En utilisant les électrons rétrodiffusés à l&#39;image des structures sous-jacentes, un petit visage est ensuite broyé avec un faisceau d&#39;ions plus fine et la surface examinée de plus près afin de déterminer la zone exacte du visage à imager et broyé. Les paramètres du microscope sont alors définies de sorte que le visage est à plusieurs reprises broyé et imagée afin que les images de série sont collectées grâce à un volume du bloc. La pile de l&#39;image contient généralement voxels isotropes ayant des dimensions aussi petites nm 4 une dans chaque direction. Cette qualité d&#39;image dans n&#39;importe quel plan d&#39;imagerie permet à l&#39;utilisateur d&#39;analyser ultrastructure cellulaire à n&#39;importe quel angle dans la pile d&#39;images.

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Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Ce protocole décrit comment le tissu cérébral de résine intégrés peuvent être préparés et imagée dans les trois dimensions dans le faisceau d&#39;ions focalisé, microscope électronique à balayage.

Ion Beam ciblée de fraisage et de microscopie électronique à balayage du tissu cérébral

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

focussed-ion-beam-milling-scanning-electron-microscopy-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

27.8K vues.  École Polytechnique Fédérale de Lausanne. Ce protocole décrit comment le tissu cérébral de résine intégrés peuvent être préparés et imagée dans les trois dimensions dans le faisceau d'ions focalisé, microscope électronique à balayage.

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Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Préparation du tissu cérébral de souris pour microscopie électronique

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Recherche

Neurosciences

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulation génétique des neurones du cervelet granules<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em&gt; À étudier neuronale Morphologie et migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Le système olfactif comme un modèle pour étudier des modèles axonale croissance et la morphologie<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called &#8220;concentric&#8221; ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.

We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.

Microélectrodes à double canon et concentrique pour la mesure de signaux extracellulaires Ion dans le tissu cérébral

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain tissue itself must be well characterized at various length and time scales. Like many biological tissues, brain tissue exhibits a complex, hierarchical structure. However, in contrast to most other tissues, brain is of very low mechanical stiffness, with Young&#39;s elastic moduli E on the order of 100s of Pa. This low stiffness can present challenges to experimental characterization of key mechanical properties. Here, we demonstrate several mechanical characterization techniques that have been adapted to measure the elastic and viscoelastic properties of hydrated, compliant biological materials such as brain tissue, at different length scales and loading rates. At the microscale, we conduct creep-compliance and force relaxation experiments using atomic force microscope-enabled indentation. At the mesoscale, we perform impact indentation experiments using a pendulum-based instrumented indenter. At the macroscale, we conduct parallel plate rheometry to quantify the frequency dependent shear elastic moduli. We also discuss the challenges and limitations associated with each method. Together these techniques enable an in-depth mechanical characterization of brain tissue that can be used to better understand the structure of brain and to engineer bio-inspired materials.

We present a set of techniques to characterize the viscoelastic mechanical properties of brain at the micro-, meso-, and macro-scales.

Caractériser Propriétés Multiscale mécaniques des tissus de cerveau en utilisant la microscopie à force atomique, Impact indentation et Rheometry

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, tri-carboxylic acid (TCA) cycle and oxidative phosphorylation (OXPHOS) pathways to produce cellular energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Impairment of mitochondrial ATP production causes mitochondrial disorders, which present clinically with prominent neurological and myopathic symptoms. Mitochondrial defects are also present in neurodevelopmental disorders (e.g. autism spectrum disorder) and neurodegenerative disorders (e.g. amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases). Thus, there is an increased interest in the field for performing 3D analysis of mitochondrial morphology, structure and distribution under both healthy and disease states. The brain mitochondrial morphology is extremely diverse, with some mitochondria especially those in the synaptic region being in the range of &#60;200 nm diameter, which is below the resolution limit of traditional light microscopy. Expressing a mitochondrially-targeted green fluorescent protein (GFP) in the brain significantly enhances the organellar detection by confocal microscopy. However, it does not overcome the constraints on the sensitivity of detection of relatively small sized mitochondria without oversaturating the images of large sized mitochondria. While serial transmission electron microscopy has been successfully used to characterize mitochondria at the neuronal synapse, this technique is extremely time-consuming especially when comparing multiple samples. The serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) technique involves an automated process of sectioning, imaging blocks of tissue and data acquisition. Here, we provide a protocol to perform SBFSEM of a defined region from rodent brain to rapidly reconstruct and visualize mitochondrial morphology. This technique could also be used to provide accurate information on mitochondrial number, volume, size and distribution in a defined brain region. Since the obtained image resolution is high (typically under 10 nm) any gross mitochondrial morphological defects may also be detected.

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

Analyse de Brain mitochondries utilisant Serial Bloc-Face microscopie électronique à balayage

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Préparation du Primat tissu cérébral non humain pour immunohistochimie pré-enrobage et microscopie électronique

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cell excitability. Altered concentrations of extracellular K+ affect the resting membrane potential and cellular excitability by shifting the equilibria between closed, open and inactivated states for voltage-dependent ion channels that underlie action potential initiation and conduction. Hence, it is valuable to directly measure extracellular K+ dynamics in health and diseased states. Here, we describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. We deployed them in adult hippocampal brain slices to measure electrically evoked K+ concentration dynamics. The judicious use of such electrodes is an important part of the tool-kit needed to evaluate cellular and biophysical mechanisms that control extracellular K+ concentrations in the nervous system.

Potassium ions contribute&#160;to the resting membrane potential of cells and extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cellular excitability. We describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. Using such electrodes enables the measurement of electrically evoked K+ concentration dynamics in adult hippocampal slices.

Fabrication, des essais et à l’aide de microélectrodes sensibles aux ions Potassium dans des tranches de tissu du cerveau adulte

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

Tranches hippocampiques horizontales du cerveau de souris

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In addition, some features of dendritic spines, such as volume of the spine and post-synaptic density (PSD) (representing post-synaptic part of the synapse), presence of presynaptic terminal, and smooth endoplasmic reticulum or atypical form of PSD (e.g., multi-innervated spines), can be observed only with 3D EM. By employing serial block-face scanning electron microscopy (SBEM) it is possible to obtain 3D EM data easier and in a more reproducible manner than when performing traditional serial sectioning. Here we show how to prepare mouse hippocampal samples for SBEM analysis and how this protocol can be combined with immunofluorescence study of dendritic spines. Mild fixation perfusion allows us to perform immunofluorescence studies with light microscopy on one half of the brain, while the other half was prepared for SBEM. This approach reduces the number of animals to be used for the study.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) is applied to image and analyze dendritic spines in the murine hippocampus.

Microscopie électronique à balayage en bloc en série (SBEM) pour l’étude des épines dendritiques

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...