Nous remercions N. Schwedhelm-Domeyer pour une excellente assistance technique, C. et S. Marteau Papiol l&#39;aide d&#39;analyses statistiques. Notre travail est financé par la Société Max Planck, la Deutsche Forschungsgemeinschaft, le Center for Nanoscale Microscopie et physiologie moléculaire du cerveau (CNMPB), Göttingen, en Allemagne et par la GGNB junior Groupe Allocation de l&#39;Université de Göttingen.

CGN peuvent être préparés soit à partir du jour post-natal (P) 5 souriceaux ou P6 de rat pups. Nous suivons un protocole, décrit par Bilimoria et ses collègues, qui utilise un inhibiteur mitotique pour sélectionner les CGN postmitotiques 13. Déclaration d&#39;éthique: Toutes les expériences impliquant des animaux vivants ont été menées selon le protocole des animaux approuvée par le &quot;Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit&quot; de Basse-Saxe, Allemagne. Test in vitro: Une. Préparation de l&#39;ADN plasmidique, des médias, et des tampons pour le phosphate de calcium Méthode de transfection <ol><li> Dissoudre l&#39;ADN plasmidique dans de l&#39;eau stérile, exempt d&#39;endotoxine; DMEM (taux élevé de glucose); faire 2,5 M CaCl 2; faire 2x HBSS (dissout 4 g de NaCl, 0,1775 g de KCl, 0,095 g Na 2 HPO 4 • 7H 2 O, 0,675 g glucose et 2,5 g HEPES dans 250 ml d&#39;eau ultra-pure et ajuster le pH à 7,05, 7,08 et 7,11). Remarque: Lors de la préparationla solution HBSS 2x, test qui pH donne les meilleurs résultats en ce qui concerne l&#39;efficacité de transfection de combinaison donnée de plasmides. </li></ol> 2. La transfection de neurones de culture <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51070/51070fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51070/51070fig1.jpg" /> Figure 1. Organigramme de l&#39;axone in vitro et analyse de la croissance des dendrites. Cultivé CGN (de plaque de 24 puits avec des lamelles de verre), isolé à partir de ratons P6, sont transfectées à DIV 0 ou 1 avec précipité d&#39;ADN contenant un marqueur de transfection fluorescent (par exemple GFP). Après fixation et immunocytochimie, les neurones sont imagés de façon aveugle. Les images sont importées dans ImageJ et processus sont évalués. Les mesures sont ensuite traitées à l&#39;aide d&#39;un programme statistique. <ol><li> CGN de semences (20 x 10 6 par plaque de 24 puits; BME, le sérum de veau à 10%, 2 mM de pénicilline-Streptomycin-glutamine (PSG), 25 mM de KCl) sur 12 mm, lamelles nitrique lavés à l&#39;acide polyornithine revêtu verre dans une plaque de 24 puits avec 500 pi de milieu par puits. </li><li> Le jour in vitro (DIV) 0 (au moins 8 heures après placage) ou DIV 1, recueillir des milieux de croissance et maintenir à 37 ° C. Laver les neurones deux fois avec 500 ul de DMEM préchauffé et ajouter 500 ul de DMEM. </li><li> Placer les neurones dans l&#39;incubateur (37 ° C, 5% CO 2) pendant 45 min. </li><li> Préparer 40 ul ADN précipité pour chaque puits en mélangeant: ADN (2-2,5 pg / puits, 10% de l&#39;ADN total devrait être un marqueur transfection par exemple GFP pour visualiser les neurones transfectées), l&#39;eau (jusqu&#39;à 18 pi), ajouter 2 pi de 2,5 M CaCl 2, bien mélanger et ajouter 20 ul de HBSS 2x. <ol><li> Incuber l&#39;ADN précipité pendant 5 min à température ambiante. </li></ol></li><li> Ajouter précipité d&#39;ADN dans chaque puits et incuber neurones pendant 18 minutes dans l&#39;incubateur. </li><li> Retirer DMEM / ADN mélange et laver les neurones à deux reprises avec 500 pi de DM préchaufféEM. </li><li> Ajouter un média recueillies à l&#39;étape 2.2 de retour pour les neurones. Si les neurones seront en culture pendant plus de 3 jours, les médias de supplément avec 25 mM de glucose à 3 DIV pour reconstituer source de carbone. </li><li> Après 1-5 jours, les neurones soumis à immunocytochimie en utilisant des anticorps de la GFP. </li><li> Image au moins 30 neurones individuels par l&#39;état d&#39;une manière aveugle utilisant un microscope à fluorescence. </li></ol> 3. Mesurer axones et des dendrites avec NeuronJ, un ImageJ Plugin NIH Important: Assurez-vous que les images sont redimensionnées correctluy en utilisant pixel approprié: rapport um selon grossissement et la résolution de l&#39;image. <ol><li> Convertir des images en 8 bits avec ImageJ: Ouvrir l&#39;image, choisissez &quot;Image&quot; -&gt; &quot;Type&quot; -&gt; &#39;8-bit &#39;-&gt;&#39; image Sauvegarder ». </li><li> Exécutez NeuronJ plugin et ouvrir l&#39;image 8 bits. <img alt="Capture d&#39;écran" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot1.jpg" width="500px" /></li><li> Utilisez l&#39;option «Ajouter des tracés de suivre l&#39;axone: click le bouton gauche de la souris une fois au début de l&#39;axone et déplacer la souris le long du processus. Double-cliquez sur la pointe de l&#39;axone si trace correspond forme axonale. <img alt="Capture d&#39;écran" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot2.jpg" width="500px" /> Remarque: Si la trace suggéré différer de forme axonale, cliquez une fois sur le processus axonal pour ancrer trace, puis double-cliquez sur l&#39;extrémité de l&#39;axone. </li><li> Cliquez sur «tracés de mesure», choisissez l&#39;option &#39;Affichage traçage mesures de choix et appuyez sur &quot;Exécuter&quot;. Mesures Axon sont tous affichés dans une nouvelle fenêtre. Pour dendrites, choisissez l&#39;option &#39;des mesures de groupe d&#39;affichage &quot;et appuyez sur&quot; Exécuter &quot;. <img alt="Capture d&#39;écran" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot3.jpg" width="500px" /> Nombre de mesures dendritiques sont tous affichés dans une nouvelle fenêtre. Conservez-les dans un fichier distinct qui peut être ouvert dans n&#39;importe quel tableur. </li><li> Sinon, pour le traçage manuel, utiliser un logiciel Fidji: un clic droit sur ee option &#39;ligne droite&#39;, choisissez &#39;ligne à main levée », <img alt="Capture d&#39;écran" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot4.jpg" width="500px" /> maintenez le bouton gauche de la souris enfoncé et tracer manuellement le processus, appuyez sur Ctrl + M &#39;à mesurer. </li><li> Calculer la longueur moyenne dendritique / axonal par état et utiliser le test statistique approprié. Dans l&#39;électroporation in vivo: </li></ol> Une. Équipement et Préparation des réactifs <ol><li> Vous devez G 30 aiguilles, écartement (1-2 mm), une seringue, mort réducteur de volume (DVR), électroporateur et tweezertrodes, coussin chauffant ou lampe infrarouge, lampe à col de cygne et l&#39;isoflurane. </li><li> Mettez DVR en aiguille, puis fixer l&#39;aiguille à la seringue, et enfin mettre entretoise sur l&#39;aiguille (figure 2). <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51070/51070fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51070/51070fig2.jpg" /> Figure2. Préparation de l&#39;aiguille. DVR est coupée une pointe de pipette 200 ul et placé dans l&#39;aiguille à réduire le volume mort. Entretoise est dérivé d&#39;un embout 200 ul de chargement et est placé sur l&#39;extrémité de l&#39;aiguille pour régler la profondeur de pénétration dans le cervelet à environ 2 mm. unités de la règle: cm </li><li> Dissoudre l&#39;ADN dans PBS/0.03% vert rapide. Remarque: En tant que marqueur de transfection, il est avantageux d&#39;utiliser une protéine fluorescente qui est sous un promoteur spécifique des neurones (par exemple Synapsin) pour visualiser les neurones seulement. 25% de la quantité totale de plasmide doit être le plasmide codant pour le marqueur de transfection. </li><li> Assurez-éthanol à 70%. </li><li> Mélanger des volumes égaux d&#39;octobre et 30% de saccharose dissous dans du PBS. </li><li> Remplir la seringue avec 4 ul de l&#39;ADN (4 ug / ul d&#39;ADN plasmidique dans PBS/0.03% Fast Green). </li></ol> 2. IVE du Rat chiots Organigramme du système IVE: voir la figure 3 <p class="jove_content" fo:keep-together.withinPage = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51070/51070fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51070/51070fig3.jpg" /> Figure 3. Organigramme des chiots P4 de rat in vivo. Électroporation sont anesthésiés avec de l&#39;isoflurane et de l&#39;ADN plasmidique codant pour un marqueur fluorescent de transfection (par exemple, GFP) est injecté dans le cervelet, suivie d&#39;une exposition à 5 impulsions électriques. Cinq jours plus tard, isolé cervelet GFP-positives sont sectionné et soumis à l&#39;immunohistochimie. Les images sont capturées à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal et analysées avec le logiciel Imaris. Les données sont traitées avec un programme statistique. <ol><li> Utilisez les ratons P4 de la souche albinos (Wistar ou Long Evans). </li><li> Anesthésier petits (un après l&#39;autre) avec de l&#39;isoflurane dans une petite boîte (par exemple P1000 boîte de pointe de la pipette) avec 200 pi de l&#39;isoflurane (trempés dans le tissu) pour 1-2 min jusqu&#39;à ce chiot n&#39;est plus en mouvement. Veillez à ce que les petits ne reçoivent pas en contact avecvec Iiquide isoflurane. Surveiller le temps près chiots individuels réagissent différemment à l&#39;anesthésie. </li><li> Stériliser arrière de la tête de chien avec 70% d&#39;éthanol. </li><li> Fixer la tête de chiot entre le pouce et l&#39;index et utiliser la lampe à col de cygne pour localiser cervelet de chiot albinos. Le sinus transverse délimite nettement le mésencéphale (colliculus supérieur et inférieur) des hémisphères corticaux (Figure 3). Le cervelet est situé à côté du mésencéphale et apparaît dans une teinte plus foncée. Utilisez un marqueur permanent pour indiquer le cervelet avec un point. Important: Gardez chiot en position fixe! Remarque: Si l&#39;anesthésie s&#39;estomper au cours de cette procédure, exposer chiot à l&#39;isoflurane avant l&#39;injection de l&#39;ADN. </li><li> Insérer l&#39;aiguille (figure 3) et injecter lentement 3 pl de l&#39;ADN dans le cervelet. </li><li> Laissez la solution d&#39;ADN pour diffuser 30-60 sec. <ol><li> Placez la tête de chiot entre tweezertrodes de sorte que le pôle négatif est en contact avec l&#39;arrière de la tête (cerveletrégion r) et que les contacts du pôle de plus le côté opposé de la tête (figure 3). </li><li> Chiot soumis à 5 impulsions électriques. Ajuster la tension de masse de petits pour assurer une bonne efficacité de l&#39;électroporation, sans compromettre leur survie (tableau 1). <table border="0"><tbody><tr><td> Poids </td><td> Tension </td><td> Pouls </td><td> Intervalle </td></tr><tr><td> 8-9 g </td><td> 160 V </td><td> 50 ms </td><td> 950 ms </td></tr><tr><td> 9-10 g </td><td> 165 V </td><td> 50 ms </td><td> 950 ms </td></tr><tr><td> &gt; 10 g </td><td> 170 V </td><td> 50 msec </td><td> 950 ms </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Électroporation de ratons P4. </li><li> Laissez les petits récupérer sur coussin chauffant ou sous une lampe infrarouge. Retour chiots de barrage. Important: Assurez-vous que la source de chauffage n&#39;inflige pas de brûlures. </li></ol></li><li> Sacrifiez chiots 5 jours après l&#39;électroporation en les plaçant dans le CO 2 suivie par décapitation. <ol><li> Isoler le cervelet et d&#39;un écran pour les GFP-positives cervelet en utilisant un microscope à fluorescence. </li></ol></li><li> Fixer cervelet dans 4% PFA O / N à 4 ° C, puis incuber à 30% de saccharose à 4 ° C jusqu&#39;à ce que cerebella évier à fond du tube. </li><li> Incluez cervelet dans OCT/30% de saccharose et de réduire de 40 um coupes coronales en utilisant un cryostat. Note: L&#39;article chaque cervelet à l&#39;aveugle. </li><li> Sections de immunohistochimie en utilisant l&#39;anticorps de la GFP. Contre-colorer avec un colorant nucléaire (DAPI ou Hoechst 33258) et déterminer la localisation d&#39;au moins 200 neurones transfectées par animal. </li><li> Pour une analyse en profondeur, subdiviser l&#39;IGL en deux moitiés, résultant en une IGL supérieure face à la ML et une IGL inférieure tournée vers la matière blanche et de compter les neurones GFP-positives résidant dans chaque moitié. Note: Comptez neurones GFP-positives de chaque section en aveugle. </li&gt; </ol> 3. Mesure Dendrite Longueur, Acquérir les images de la section en x, y, z avion en utilisant un microscope confocal Remarque: par exemple, utiliser 40 images pour une section de 40 pm avec un z-stwp de 1 um. <ol><li> Ouvrir série d&#39;images dans le logiciel, Imaris, pour générer une image 3D des dendrites. </li><li> Cliquez sur le mode «surpasser» pour voir le neurone en 3D. <img alt="Capture d&#39;écran" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot5.jpg" width="500px" /></li><li> Sélectionnez «Ajouter un filament&quot; et cliquez sur &quot;Passer la création automatique» pour commencer le traçage semi-automatique. <img alt="Capture d&#39;écran" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot6.jpg" width="500px" /> Remarque: Analyser chaque image 3D d&#39;une manière aveugle </li><li> Sélectionnez l&#39;onglet «Dessiner» et «AutoPath. <img alt="Capture d&#39;écran" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot7.jpg" width="500px" /></li><li> Déplacez le curseur de la souris sur le ccorps ell et Maj + clic droit pour sélectionner le corps de la cellule. Remarque: Autocalculation par le logiciel peut nécessiter quelques minutes. <img alt="Capture d&#39;écran" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot8.jpg" width="500px" /></li><li> Ajouter chemins à filament (dendrites) avec Shift + clic gauche. Remarque: Les chemins peuvent être visualisés en temps réel. <img alt="Capture d&#39;écran" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot9.jpg" width="500px" /></li><li> Allez à la fenêtre de statistiques à incandescence et cliquer sur, les «valeurs spécifiques» «détaillées» et «longueur du filament de dendrites (somme) &#39;pour somme de la longueur totale de dendrites. <img alt="Capture d&#39;écran" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot10.jpg" width="500px" /></li><li> Utilisez tests statistiques appropriés pour analyser les données. </li></ol>

<ol>
	<li>Cajal, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histology of the nervous system of man and vertebrates. , (1995).</li><li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).</li><li>White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wholemount+immunohistochemistry+for+revealing+complex+brain+topography.">Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Palay, S. L., Chan-Palay, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cerebellar cortex: cytology and organization. , (1974).</li><li>Hatten, M. E., Alder, J., Zimmerman, K., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+involved+in+cerebellar+cell+specification+and+differentiation.">Genes involved in cerebellar cell specification and differentiation.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 7, 40-47 (1997).</li><li>Hatten, M. E., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+neural+patterning+and+specification+in+the+developing+cerebellum.">Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum.</a> Annu. Rev. Neurosci. 18, 385-408 (1995).</li><li>Sillitoe, R. V., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+molecular+codes,+and+circuitry+produce+the+three-dimensional+complexity+of+the+cerebellum.">Morphology molecular codes, and circuitry produce the three-dimensional complexity of the cerebellum.</a> Ann. Rev. Dev. Biol. 23, 549-577 (2007).</li><li>Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+behaviors+and+genetic+lineages+of+the+mesencephalon+and+rhombomere+1.">Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1.</a> Neuron. 43, 345-357 (2004).</li><li>Wingate, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rhombic+lip+and+early+cerebellar+development.">The rhombic lip and early cerebellar development.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).</li><li>Kawaji, K., Umeshima, H., Eiraku, M., Hirano, T., Kengaku, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+phases+of+migration+of+cerebellar+granule+cells+guided+by+axonal+and+dendritic+leading+processes.">Dual phases of migration of cerebellar granule cells guided by axonal and dendritic leading processes.</a> Mol. Cell Neurosci. 25, 228-240 (2004).</li><li>Hatten, M. E., Gao, W. -. Q., Morrison, M. E., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+neuroscience.">Cellular and molecular neuroscience.</a> , 419-41 .</li><li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons.">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li><li>Bilimoria, P. M., Bonni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultures+of+cerebellar+granule+neurons.">Cultures of cerebellar granule neurons.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Rivas, R. J., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+and+cytoskeletal+organization+of+migrating+cerebellar+granule+neurons.">Motility and cytoskeletal organization of migrating cerebellar granule neurons.</a> J. Neurosci. 15, 981-989 (1995).</li><li>Kuhar, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+patterns+of+gene+expression+define+four+stages+of+cerebellar+granule+neuron+differentiation.">Changing patterns of gene expression define four stages of cerebellar granule neuron differentiation.</a> Development. 117, 97-104 (1993).</li><li>Baird, D. H., Hatten, M. E., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+target+neurons+provide+a+stop+signal+for+afferent+neurite+extension+in+vitro.">Cerebellar target neurons provide a stop signal for afferent neurite extension in vitro.</a> J. Neurosci. 12, 619-634 (1992).</li><li>Segal, R. A., Pomeroy, S. L., Stiles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+growth+and+fasciculation+linked+to+differential+expression+of+BDNF+and+NT3+receptors+in+developing+cerebellar+granule+cells.">Axonal growth and fasciculation linked to differential expression of BDNF and NT3 receptors in developing cerebellar granule cells.</a> J. Neurosci. 15, 4970-4981 (1995).</li><li>Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+release+of+glutamate+from+cerebellar+granule+cells+differentiating+in+culture.">Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7919-7923 (1982).</li><li>Smith, T. C., Wang, L. Y., Howe, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+kainate+receptor+phenotypes+in+immature+and+mature+mouse+cerebellar+granule+cells.">Distinct kainate receptor phenotypes in immature and mature mouse cerebellar granule cells.</a> Physiol. 517 (1), 51-58 (1999).</li><li>Konishi, Y., Stegmuller, J., Matsuda, T., Bonni, S., Bonni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdh1-APC+controls+axonal+growth+and+patterning+in+the+mammalian+brain).">Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain).</a> Science. 303, 1026-1030 (2004).</li><li>Stegmuller, J., Huynh, M. A., Yuan, Z., Konishi, Y., Bonni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta-Smad2+signaling+regulates+the+Cdh1-APC/SnoN+pathway+of+axonal+morphogenesis.">TGFbeta-Smad2 signaling regulates the Cdh1-APC/SnoN pathway of axonal morphogenesis.</a> J. Neurosci. 28, 1961-1969 (2008).</li><li>Stegmuller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+regulation+of+axonal+morphogenesis+by+the+Cdh1-APC+target+SnoN.">Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN.</a> Neuron. 50, 389-400 (2006).</li><li>Kannan, M., Lee, S. J., Schwedhelm-Domeyer, N., Nakazawa, T., Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p250GAP+is+a+novel+player+in+the+Cdh1-APC/Smurf1+pathway+of+axon+growth+regulation.">p250GAP is a novel player in the Cdh1-APC/Smurf1 pathway of axon growth regulation.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Kannan, M., Lee, S. J., Schwedhelm-Domeyer, N., Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E3+ligase+Cdh1-anaphase+promoting+complex+operates+upstream+of+the+E3+ligase+Smurf1+in+the+control+of+axon+growth.">The E3 ligase Cdh1-anaphase promoting complex operates upstream of the E3 ligase Smurf1 in the control of axon growth.</a> Development. 139, 3600-3612 (2012).</li><li>Gaudilliere, B., Konishi, Y., de la Iglesia, N., Yao, G., Bonni, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII-NeuroD+Signaling+Pathway+Specifies+Dendritic+Morphogenesis.">CaMKII-NeuroD Signaling Pathway Specifies Dendritic Morphogenesis.</a> Neuron. 41, 229-241 (2004).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cdc20-APC+ubiquitin+signaling+pathway+regulates+presynaptic+differentiation.">A Cdc20-APC ubiquitin signaling pathway regulates presynaptic differentiation.</a> Science. 326, 575-578 (2009).</li><li>Litterman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+OBSL1-Cul7Fbxw8+ubiquitin+ligase+signaling+mechanism+regulates+Golgi+morphology+and+dendrite+patterning.">An OBSL1-Cul7Fbxw8 ubiquitin ligase signaling mechanism regulates Golgi morphology and dendrite patterning.</a> PLoS Biol. 9, (2011).</li><li>Kim, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+centrosomal+Cdc20-APC+pathway+controls+dendrite+morphogenesis+in+postmitotic+neurons.">A centrosomal Cdc20-APC pathway controls dendrite morphogenesis in postmitotic neurons.</a> Cell. 136, 322-336 (2009).</li><li>Shalizi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+calcium-regulated+MEF2+sumoylation+switch+controls+postsynaptic+differentiation.">A calcium-regulated MEF2 sumoylation switch controls postsynaptic differentiation.</a> Science. 311, 1012-1017 (2006).</li><li>Vadhvani, M., Schwedhelm-Domeyer, N., Mukherjee, C., Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Centrosomal+E3+Ubiquitin+Ligase+FBXO31-SCF+Regulates+Neuronal+Morphogenesis+and+Migration.">The Centrosomal E3 Ubiquitin Ligase FBXO31-SCF Regulates Neuronal Morphogenesis and Migration.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>Puram, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CaMKIIbeta+signaling+pathway+at+the+centrosome+regulates+dendrite+patterning+in+the+brain.">A CaMKIIbeta signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain.</a> Nat. Neurosci. , (2011).</li><li>Jia, Y., Zhou, J., Tai, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPC+channels+promote+cerebellar+granule+neuron+survival.">TRPC channels promote cerebellar granule neuron survival.</a> Nat. Neurosci. 10, 559-567 (2007).</li><li>Huynh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isoform-specific+SnoN1-FOXO1+repressor+complex+controls+neuronal+morphogenesis+and+positioning+in+the+mammalian+brain.">An isoform-specific SnoN1-FOXO1 repressor complex controls neuronal morphogenesis and positioning in the mammalian brain.</a> Neuron. 69, 930-944 (2011).</li><li>de la Torre-Ubieta, L., Bonni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+neuronal+polarity+and+morphogenesis+in+the+mammalian+brain.">Transcriptional regulation of neuronal polarity and morphogenesis in the mammalian brain.</a> Neuron. 72, 22-40 (2011).</li><li>Calissano, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+insulin-like+growth+factor+I+exerts+a+trophic+action+and+confers+glutamate+sensitivity+on+glutamate-resistant+cerebellar+granule+cells.">Recombinant human insulin-like growth factor I exerts a trophic action and confers glutamate sensitivity on glutamate-resistant cerebellar granule cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8752-8756 (1993).</li></ol>

Les auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrents.

Avantages et limites de l&#39;décrite in vitro et des méthodes in vivo: CGN culture de la souris et les rats sont également bien adaptés pour les analyses morphologiques. En raison de la plus grande taille d&#39;un cervelet de rat, le rendement en CNGS de bébés rats est supérieure à celle des souriceaux 3-4x. Mis à part CGN, les neurones corticaux et hippocampiques peuvent être utilisés comme système de culture. La méthode au phosphate de calcium se traduit par...

Le cervelet est un excellent système pour étudier les mécanismes de la croissance axonale et la migration. Le cervelet a été l&#39;objet d&#39;études anatomiques depuis l&#39;aube des neurosciences 1. Microscopie moderne et des techniques d&#39;immunohistochimie ont considérablement élargi et affiné les premières découvertes de Santiago, Ramon, et Cajal 2-4. la génétique des souris et des études moléculaires ont découvert des facteurs de croissance et de transcription essentiels dans le contrôle du développement du cervelet, qui a conduit à une meilleure compréhension des événements cruciaux nécessaires au bon câblage des différents types de neurones dont les neurones granulaires du cervelet (SCT) 5-7. Le cervelet est un dérivé d&#39;une rhombomère du cerveau postérieur développement 8. La lèvre rhombique, qui fait partie de la toiture de la 4 e ventricule, donne naissance à des progéniteurs cérébelleux granule de neurones, qui constitueront les plus nombreux dans la population neuronalecervelet adulte 9. Après la migration rostrale, ils s&#39;installent dans l&#39;ébauche du cervelet. Ici, la mitose de précurseurs granule de neurones conduit à l&#39;expansion spectaculaire de la couche granulaire externe (EGL), qui a lieu après la naissance chez les rongeurs. De l&#39;EGL, les neurones commencent à migrer vers l&#39;intérieur à travers la couche moléculaire (ML), au-delà de la couche des cellules de Purkinje de prendre finalement la résidence dans la couche granulaire interne (IGL 2). Au cours de ce processus migratoire, ils acquièrent une forme bipolaire avec deux axones s&#39;étendant dans le ML. Après poursuite de la migration, le corps de la cellule migre à l&#39;écart des axones et les deux processus fusionnent pour former une forme de fourche, axone en forme de T 10. Par la suite, ces axones fasciculées et sont appelées fibres comme parallèles. S&#39;étant établi à l&#39;IGL, CGN poussent dendrites, qui forment des griffes dendritiques à établir des synapses des fibres moussues. Pour examiner les processus fondamentaux dans le cervelet en développement, un combiné in vitro et in vivo approach permet des résultats fiables et conclusions. CGN ne sont pas seulement les plus nombreux neurones du cervelet, mais de l&#39;ensemble du cerveau et peuvent être cultivées à haute pureté 11-13. Dans la culture, cette population neuronale très homogène devient rapidement postmitotique et acquiert une morphologie polaire avec axones et des dendrites facilement identifiables. CGN culture se sont avérées extrêmement utiles pour étudier les différents aspects du développement neuronal, y compris ancêtre prolifération, la différenciation, axonale et le développement des dendrites, migration neuronale, l&#39;apoptose et les propriétés électrophysiologiques (14-19 et bien d&#39;autres). L&#39;utilisation de la manipulation génétique a élargi la polyvalence de CGN culture et a permis en outre une approche mécanistique sur les événements mentionnés ci-dessus. La transfection de neurones en culture à l&#39;aide de faible efficacité du phosphate de calcium ou lipophiles méthodes suivies par immunocytochimie avec des marqueurs de polarité ou par logiciel supporté analyse facilitertats de l&#39;évaluation, par exemple de la morphologie des neurones individuels dans une culture neuronale dense. Avec cette approche, le rôle des protéines d&#39;intérêt dans l&#39;axone ou dendrites croissance peut être étudiée 20-25,26-28. Ce système de culture est toutefois moins utile d&#39;analyser la migration neuronale que la migration est très limité dans les cultures à haute densité et exigerait co-cultures. L&#39;analyse in vitro de l&#39;axone et la croissance de dendrites permet également à l&#39;examen des protéines interconnectés d&#39;une voie de signalisation en utilisant les combinaisons de l&#39;interférence ARN (i), la sur-expression ou de petites molécules. Pour établir l&#39;utilité de la protéine d&#39;intérêt dans l&#39;axone et la régulation de la croissance de la dendrite ou de la migration neuronale, l&#39;électroporation in vivo (IVE) de technique permet l&#39;analyse dans le cortex cérébelleux développement. En raison du fait que le développement cérébelleux chez des rongeurs s&#39;étend chemin dans les deux premières semaines après la naissance, le cervelet représente un AccessiBla structure du cerveau pour le manipulations génétiques pour examiner le développement des axones et des dendrites, la migration neuronale, synaptogenèse et l&#39;apoptose 20-24,29,30,26,27,31-34. En outre, ce système modèle est également utile pour d&#39;autres aspects du développement neuronal qui nécessitent le cortex cérébelleux intact comme des axones, le câblage et la connectivité des neurones et des interactions neurone-glie Pris ensemble, ce protocole prévoit in vitro et des techniques in vivo pour lutter contre une approche complémentaire concernant la morphogenèse neuronale et la migration.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="541">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">DMEM</td>
			<td style="width:125px;">Gibco</td>
			<td style="width:88px;">11960-044</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">BME</td>
			<td style="width:125px;">Gibco</td>
			<td style="width:88px;">41010-026</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">Insulin</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">Si-1-4011</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">Poly-L-Ornithine</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">P-2533</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:160px;">CaCl2</td>
			<td style="width:125px;">Appli-Chem</td>
			<td style="width:88px;">A3652</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:160px;">Isofluorane</td>
			<td style="width:125px;">Actavis Deutschland</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">Tissue-Tek OCT</td>
			<td style="width:125px;">Sakura</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:160px;">Material Name</td>
			<td style="width:125px;">Company</td>
			<td style="width:88px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:168px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">ECM 830 and tweezertrodes</td>
			<td style="width:125px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:160px;">Epifluorescence microscope and camera</td>
			<td style="width:125px;">Nikon</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">SP2 confocal microscope</td>
			<td style="width:125px;">Leica</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">ImageJ</td>
			<td style="width:125px;">NIH</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">Imaris 7.4.2</td>
			<td style="width:125px;">Bitplane, Inc.</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">GraphPad Prism</td>
			<td style="width:125px;">GraphPad Software, Inc.</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">MS Excel</td>
			<td style="width:125px;">Microsoft</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">Loading tip 1-200 &#181;l</td>
			<td style="width:125px;">Costar</td>
			<td style="width:88px;">4853</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">Pipette tip 200 &#181;l</td>
			<td style="width:125px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:88px;">70.760.502</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">Microlance 3 needle, 30 gauge</td>
			<td style="width:125px;">BD</td>
			<td style="width:88px;">302200</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">50 &#181;l gastight Syringe 1705</td>
			<td style="width:125px;">Hamilton</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">Glass coverslips&#160;</td>
			<td style="width:125px;">Thermo Scientific Menzel Glaeser</td>
			<td>CB00120RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration

Événements de développement du cerveau, y compris la morphogenèse neuronale et la migration sont des processus très orchestrés. In vitro et in vivo analyses permettre une caractérisation approfondie pour identifier les voies de signalisation impliquées dans ces événements. Neurones granulaires du cervelet (CGN) qui sont dérivées à partir de cervelet de développement sont un système de modèle idéal qui permet des analyses morphologiques. Ici, nous décrivons une méthode de comment manipuler génétiquement CGN et comment étudier axono et dendritogénèse des neurones individuels. Avec cette méthode, les effets de l&#39;interférence de l&#39;ARN, la surexpression ou de petites molécules peuvent être comparées pour contrôler les neurones. En outre, le cortex cérébelleux de rongeur est un endroit facilement accessible dans le système in vivo en raison de son développement postnatal prédominant. Nous présentons également une technique in vivo dans d&#39;électroporation à manipuler génétiquement le cervelet en développement et décrire cérébelleuse analyses ultérieures pour évaluer la morphologie neuronale unee migration.

Pour analyser la morphologie de CGN en réponse à différentes conditions de culture, nous avons transfecté des neurones sur DIV 0 comme décrit ci-dessus. Après transfection, nous avons placé une série de neurones dans du milieu complet (BME, 10% de sérum de veau, 2 mM de PSG, 25 mM de KCl) et un autre ensemble dans un milieu contenant de l&#39;insuline minimal (BME, 25 mM de glucose, mM PSG 2, 10 ug / ml d&#39;insuline). Nous avons soumis les neurones à immunocytochimie en utilisant l&#39;anticorps de la GFP au...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration at JoVE.com

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Morphogenèse neuronale et la migration sont des événements cruciaux qui sous-tendent le développement normal du cerveau. Ici, nous décrivons des méthodes pour manipuler génétiquement les neurones granulaires du cervelet en culture et le cervelet en développement pour l&#39;évaluation de la morphologie et les caractéristiques de migration des neurones.

Manipulation génétique des neurones du cervelet granules<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em&gt; À étudier neuronale Morphologie et migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

genetic-manipulation-cerebellar-granule-neurons-vitro-vivo-to-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

13.6K vues.  Max Planck Institute of Experimental Medicine.  Morphogenèse neuronale et la migration sont des événements cruciaux qui sous-tendent le développement normal du cerveau. Ici, nous décrivons des méthodes pour manipuler génétiquement les neurones granulaires du cervelet en culture et le cervelet en développement pour l'évaluation de la morphologie et les caractéristiques de migration des neurones. 

Vidéo: Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3. Specifically, it affects the ability of neurons to receive inputs from other cells2 and contributes to the propagation of action potentials4,5. The morphology of the neurites also affects how information is processed. The diversity of dendrite morphologies facilitate local and long range signaling and allow individual neurons or groups of neurons to carry out specialized functions within the neuronal network6,7. Alterations in dendrite morphology, including fragmentation of dendrites and changes in branching patterns, have been observed in a number of disease states, including Alzheimer's disease8, schizophrenia9,10, and mental retardation11. The ability to both understand the factors that shape dendrite morphologies and to identify changes in dendrite morphologies is essential in the understanding of nervous system function and dysfunction.
Neurite morphology is often analyzed by Sholl analysis and by counting the number of neurites and the number of branch tips. This analysis is generally applied to dendrites, but it can also be applied to axons. Performing this analysis by hand is both time consuming and inevitably introduces variability due to experimenter bias and inconsistency. The Bonfire program is a semi-automated approach to the analysis of dendrite and axon morphology that builds upon available open-source morphological analysis tools. Our program enables the detection of local changes in dendrite and axon branching behaviors by performing Sholl analysis on subregions of the neuritic arbor. For example, Sholl analysis is performed on both the neuron as a whole as well as on each subset of processes (primary, secondary, terminal, root, etc.) Dendrite and axon patterning is influenced by a number of intracellular and extracellular factors, many acting locally. Thus, the resulting arbor morphology is a result of specific processes acting on specific neurites, making it necessary to perform morphological analysis on a smaller scale in order to observe these local variations12.
The Bonfire program requires the use of two open-source analysis tools, the NeuronJ plugin to ImageJ and NeuronStudio. Neurons are traced in ImageJ, and NeuronStudio is used to define the connectivity between neurites. Bonfire contains a number of custom scripts written in MATLAB (MathWorks) that are used to convert the data into the appropriate format for further analysis, check for user errors, and ultimately perform Sholl analysis. Finally, data are exported into Excel for statistical analysis. A flow chart of the Bonfire program is shown in Figure 1.

We have developed a computer program to analyze neuronal morphology. In combination with two existing open source analysis tools, our program performs Sholl analysis and determines the number of neurites, branch points, and neurite tips. The analyses are performed so that local changes in neurite morphology can be observed.

Analyse automatisée des Sholl morphologie neuronale numérisés à de multiples échelles

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Recherche

Neurosciences

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivirus médiée par manipulation génétique et de visualisation des neurones sensoriels olfactifs In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Analyse quantitative des vésicules reconstitution Piscine synaptique dans des cultures de neurones granulaires du cervelet utilisant des colorants FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rapide Micro-iontophorèse de glutamate et le GABA: un outil utile d&#39;étudier l&#39;intégration synaptique

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted area of the brain, neural stem cells proliferate and constantly generate neuroblasts that migrate tangentially in chains along the rostral migratory stream (RMS) to reach the olfactory bulb (OB). Once in the OB, neuroblasts switch to radial migration and then differentiate into mature neurons able to incorporate into the preexisting neuronal network. Proper neuroblast migration is a fundamental step in neurogenesis, ensuring the correct functional maturation of newborn neurons. Given the ability of SVZ-derived neuroblasts to target injured areas in the brain, investigating the intracellular mechanisms underlying their motility will not only enhance the understanding of neurogenesis but may also promote the development of neuroregenerative strategies.
This manuscript describes a detailed protocol for the transfection of primary rodent RMS postnatal neuroblasts and the analysis of their motility using a 3D in vitro migration assay recapitulating their mode of migration observed in vivo. Both rat and mouse neuroblasts can be quickly and efficiently transfected via nucleofection with either plasmid DNA, small hairpin (sh)RNA or short interfering (si)RNA oligos targeting genes of interest. To analyze migration, nucleofected cells are reaggregated in &#39;hanging drops&#39; and subsequently embedded in a three-dimensional matrix. Nucleofection per se does not significantly impair the migration of neuroblasts. Pharmacological treatment of nucleofected and reaggregated neuroblasts can also be performed to study the role of signaling pathways involved in neuroblast migration.

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Neuroblast migration is a crucial step in postnatal neurogenesis. The protocol described here can be used to investigate the role of candidate regulators of neuroblast migration by employing DNA/small hairpin RNA (shRNA) nucleofection and a 3D migration assay with neuroblasts isolated from the rodent postnatal rostral migratory stream.

Nucléofection de rongeurs Neuroblastes à étudier neuroblaste migrations<em&gt; In vitro</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induire la plasticité de Astrocytic récepteurs neuronaux par manipulation des taux de combustion

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Le système olfactif comme un modèle pour étudier des modèles axonale croissance et la morphologie<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Ex Vivo Imaging postnatal du cervelet granules migration cellulaire utilisant confocale Macroscopie

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and columns to facilitate brain wiring during development and information processing in developed animals. Postsynaptic neurons elaborate dendrites in type-specific patterns in specific layers to synapse with appropriate presynaptic terminals. The fly medulla neuropil is composed of 10 layers and about 750 columns; each column is innervated by dendrites of over 38 types of medulla neurons, which match with the axonal terminals of some 7 types of afferents in a type-specific fashion. This report details the procedures to image and analyze dendrites of medulla neurons. The workflow includes three sections: (i) the dual-view imaging section combines two confocal image stacks collected at orthogonal orientations into a high-resolution 3D image of dendrites; (ii) the dendrite tracing and registration section traces dendritic arbors in 3D and registers dendritic traces to the reference column array; (iii) the dendritic analysis section analyzes dendritic patterns with respect to columns and layers, including layer-specific termination and planar projection direction of dendritic arbors, and derives estimates of dendritic branching and termination frequencies. The protocols utilize custom plugins built on the open-source MIPAV (Medical Imaging Processing, Analysis, and Visualization) platform and custom toolboxes in the matrix laboratory language. Together, these protocols provide a complete workflow to analyze the dendritic routing of Drosophila medulla neurons in layers and columns, to identify cell types, and to determine defects in mutants.

Here, we show how to analyze dendritic routing of Drosophila medulla neurons in columns and layers. The workflow includes a dual-view imaging technique to improve the image quality and computational tools for tracing, registering dendritic arbors to the reference column array and for analyzing the dendritic structures in 3D space.

Analyse dendritique Morphologie dans les colonnes et les couches

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the co-existence of glial cells and neurons in CGN culture might lead to biases in the accurate assessment of neuronal viability. Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining has been used to measure cell viability by simultaneously evaluating the viable and dead cells. We used FDA-PI double staining to improve the sensitivities of the colorimetric assays and to evaluate neuronal viability in CGNs. Furthermore, we added blue fluorescent DNA stains (e.g., Hoechst) to improve the accuracy. This protocol describes how to improve the accuracy of assessment of neuronal viability by using these methods in CGN culture. Using this protocol, the number of glial cells can be excluded by using fluorescence microscopy. A similar strategy can be applied to distinguish the unwanted glial cells from neurons in various mixed cell cultures, such as primary cortical culture and hippocampal culture.

This protocol describes how to accurately measure neuronal viability using Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining in cultured cerebellar granule neurons, a primary neuronal culture used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research.

Évaluation de la viabilité neuronale à l&#39;aide de diacétate de fluorescéine-iodure de propidium Double coloration dans la culture du neurone de granulé céréalier

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...