This work was supported by DFG Schwerpunktprogramm 1392 (project MA 4113/2-2), cluster of Excellence and DFG Research Center Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (project B1-9), and the German Ministry of Research and Education (BMBF; project 1364480).

REMARQUE: la manipulation des animaux et des expériences ont été réalisées comme approuvé par le Comité d&#39;éthique de l&#39;Université de Göttingen pour en expérimentation animale. 1. Préparation d&#39;instruments et pipette Fabrication <ol><li> Assurez-vous que la configuration de l&#39;électroporation consiste en un microscope stéréoscopique avec une grande distance de travail et est équipé d&#39;éclairage et filtre ensembles fluorescents pour le colorant utilisé. </li><li> Pour électroporation utiliser un électroporateur cellulaire unique dédié ou un générateur d&#39;impulsions carré générique attaché à un oscilloscope. Connectez les sorties électroporateur à un porte-pipette et une électrode de bain. Connecter la borne positive du générateur d&#39;impulsions à la porte de la micropipette et la borne négative à l&#39;électrode de bain. Assurer à la fois le porte-pipette et l&#39;électrode de bain contiennent des fils d&#39;argent recouvertes d&#39;une fine couche de chlorure d&#39;argent. </li><li> Monter le porte-pipette sur un micromanipulateur pour permettre un positionnement exact. </li&gt; <li> Fabriquer micropipettes d&#39;électroporation de capillaires en verre borosilicate avec filament interne. </li><li> Utiliser un étirage de micropipettes horizontal et appliquer un protocole modifié pour la fabrication de pipettes pour des expériences de patch-clamp, comme décrit par Bestman et al., 13. </li><li> Adapter les paramètres pour produire une tige plus longue et une ouverture moindre résultant en une résistance de pipette supérieur d&#39;environ 15-20 MOhm pour l&#39;électroporation d&#39;une cellule unique. La résistance à la pipette doit être inférieur, par exemple, 3-4 Mohm, pour le marquage de groupes de cellules. </li><li> Mesure de la résistance à la pipette, soit directement avec un électroporateur seule cellule dédiée ou à calculer la loi d&#39;Ohm, après la mesure de flux de courant avec un oscilloscope après l&#39;application d&#39;une impulsion de tension définie. </li></ol> 2. Préparation de l&#39;électroporation Solution <ol><li> Dissoudre dextran couplé à un fluorophore grenouille sonnerie (98 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 1 mM de CaCl2, 2 mM de MgC2 l, glucose 5 mM, 5 mM de pyruvate de Na, 10 mM d&#39;HEPES, pH ajusté à 7,8, l&#39;osmolarité est de 230 mOsmol / l) à une concentration de 3 mM. Les cellules ne peuvent pas être étiquetés avec tant d&#39;éclat si les concentrations de colorant plus faibles sont utilisées. Préparez un grand volume de solution stock et le diviser en petites portions. Les congeler pour stockage (stable pendant des mois). NOTE: Les dextrans sont disponibles dans différentes tailles et une variété d&#39;émission / spectres d&#39;excitation (par exemple, Alexa 488-dextran 10 kD, Alexa 546-dextran 10 kD, Alexa 568-dextran 10 kD, Alexa 594-dextran 10 kD, TMR-dextran 3 kD.). </li><li> Remblayer la micropipette avec un embout de pipette allongé avec un petit volume de solution de dextrane (1-5 ul). Effleurer délicatement la micropipette avec le doigt pour enlever les bulles d&#39;air résiduelles de la pointe de la pipette. </li><li> Monter la micropipette dans le porte-pipette. Assurez-vous que le fil d&#39;argent à l&#39;intérieur de la pipette est en contact avec la solution de colorant. </li></ol> 3. Sélection des larves X. laevis &lt;/ Em&gt; <ol><li> Utilisez larves albinos de X. laevis pour les expériences. Animaux de type sauvage possèdent mélanophores de pigment rempli qui montrent émission d&#39;autofluorescence pendant confocale / imagerie multiphotonique et ne conviennent donc pas pour les expériences décrites. </li><li> Scène têtards premetamorphotic après Nieuwkoop et Faber 14. Sélectionnez têtards de stades 45-53 pour les expériences. </li></ol> 4. L&#39;électroporation de dextrans fluorophore couplé <ol><li> Placer un petit morceau de tissu dans une boîte de Pétri et le couvrir avec un petit volume d&#39;eau contenant 0,02% de tricaïne (Ethyl méthanesulfonate 3 benzoate, ajusté à pH 7). </li><li> Anesthésier les têtards dans l&#39;eau contenant 0,02% de tricaïne. Après quelques minutes, les animaux cessent mouvement. Confirmez anesthésie adéquate en touchant têtards. Ils doivent être non recevable. </li><li> Transférer délicatement le têtard de l&#39;anesthésie à la boîte de Pétri en tissu recouvert. </li><li> Assurez-vous que la électr de bainode ferme le circuit d&#39;électroporation. Assurez-vous que l&#39;électrode est en contact avec le tissu humide; un contact direct avec le têtard est pas nécessaire. </li><li> Placez la pointe de micropipette à proximité de l&#39;organe olfactif en utilisant le micromanipulateur. </li><li> Pénétrer la peau qui recouvre l&#39;organe olfactif avec la pointe de la pipette et prudemment avancer la pointe dans la couche située au centre des neurones sensoriels de l&#39;épithélium olfactif principal ou épithélium voméronasal. </li><li> Déclencher des impulsions de tension positives place pour transférer le colorant dans les neurones sensoriels. Appliquer une impulsion de tension unique (p., 25 V, longueur d&#39;impulsion de 25 ms) ou de trains d&#39;impulsions multiples (p., 50 V, longueur d&#39;impulsion de 300 ps, 400 msec de train à 200 Hz). REMARQUE: Déterminer paramètres optimaux d&#39;impulsions de tension pour l&#39;souhaité étendre l&#39;étiquetage. Réduire la tension d&#39;impulsions en amplitude, la durée et le nombre de répétitions de réduire le nombre de cellules marquées. Appliquer supérieur impulsion de tension amplitude, la durée et le nombre de pulses pour un étiquetage plus répandue. </li><li> Visualisez succès extrusion de colorant et l&#39;électroporation par des impulsions déclenchées en utilisant un éclairage fluorescent de la loupe binoculaire. Le colorant se répand rapidement dans le corps de la cellule dendritique et après l&#39;électroporation réussie. </li><li> Répétez les étapes 4.5 à 4.9 pour le deuxième organe olfactif du têtard. </li><li> Transférer le têtard dans un bécher rempli d&#39;eau fraîche pour la récupération. Après ca. 5 min les têtards se réveillent de l&#39;anesthésie et commencent mouvements de natation normales. </li><li> Après 24 h, le colorant électroporation se propage dans les neurones sensoriels et atteint le bulbe olfactif par transport axonal finalement. </li></ol> 5. Les animaux de montage pour la visualisation in vivo des cellules et des processus axonales <ol><li> Anesthésier les têtards dans l&#39;eau contenant 0,02% de tricaïne. </li><li> Soigneusement transférer têtards dans une chambre d&#39;imagerie, par exemple, un petit caoutchouc de silicium recouvert boîte de Pétri avec un évidement de têtard taille. &lt;/ Li&gt; <li> Coupez un petit rectangle dans une bande de parafilm. Couvrir le têtard avec le parafilm, laissant le télencéphale antérieur exposé à travers la fenêtre de découpe. Fixer le Parafilm avec des aiguilles sur le plat sans blesser le têtard. </li><li> Assurez-vous que le têtard est immergé dans l&#39;eau suffisante contenant 0,02% de tricaïne. </li><li> Montez la chambre de l&#39;imagerie sur la scène d&#39;un microscope multiphotonique verticale ou microscope confocal. </li><li> Acquérir une pile d&#39;images en trois dimensions du bulbe olfactif. Assurez-vous que la procédure de formation d&#39;image est aussi court que possible et ne dépasse pas 10 à 15 min. </li><li> Retour le têtard dans l&#39;eau normale dans un réservoir séparé et éviter l&#39;exposition à la lumière. Après 5 min, le têtard se réveille de l&#39;anesthésie. </li><li> Répétez les étapes 5.1-5.7 après des intervalles de temps spécifiés, par exemple., Tous les jours. </li></ol> 6. Les animaux de montage pour Ex Vivo Visualisation des cellules et des processus axonales <ol><li> Alternativement à l&#39;article 5du protocole, utiliser une préparation de cerveau excisée pour visualiser les neurones sensoriels marqués. </li><li> Anesthésier et tuer le têtard par sectionnement du cerveau à la transition à la moelle épinière. Exciser un bloc de tissu contenant les organes olfactifs, les nerfs olfactifs et le télencéphale antérieur. </li><li> Transférer le bloc de tissu à la solution de la sonnerie de grenouille et enlever le tissu conjonctif avec des ciseaux fins pour exposer la face ventrale du cerveau. </li><li> Transférer le bloc de tissu à une chambre de l&#39;imagerie et la fixer avec un cadre en platine cordes avec des fils de nylon. </li><li> Montez la chambre de l&#39;imagerie sur la scène d&#39;un microscope confocal / multiphotonique. </li><li> Acquérir une pile d&#39;images en trois dimensions du bulbe olfactif. </li></ol> 7. Traitement de l&#39;image et de l&#39;évaluation des données <ol><li> Optimiser et à des moyens non-locaux de filtrage pour améliorer la qualité d&#39;image et la visualisation des structures neuronales comme décrit par Coupé, P. et al. 15. Remarque: Les données des expériences d&#39;imagerie dans les couches profondes du tissu de spécimens vivants sont souvent bruyants. </li><li> Créer projections d&#39;intensité maximale des piles d&#39;images pour un aperçu. </li><li> Pour time-lapse expériences d&#39;imagerie écran ensembles de données pour identifier sans ambiguïté simples axones des neurones sensoriels. </li><li> Reconstruire la morphologie cellulaire via le traçage assistée par logiciel de processus neuronaux comme décrit par Peng et al. 16. </li></ol>

<ol>
	<li>Huard, J. M., Youngentob, S. L., Goldstein, B. J., Luskin, M. B., Schwob, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+olfactory+epithelium+contains+multipotent+progenitors+that+give+rise+to+neurons+and+non-neural+cells.">Adult olfactory epithelium contains multipotent progenitors that give rise to neurons and non-neural cells.</a> J. Comp. Neurol. 400 (4), 486-4810 (1998).</li><li>Schwob, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+regeneration+and+the+peripheral+olfactory+system.">Neural regeneration and the peripheral olfactory system.</a> Anat. Rec. 269 (1), 33-49 (2002).</li><li>Leung, C. T., Coulombe, P. A., Reed, R. 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S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain.">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J. Vis. Exp. (17), (2008).</li><li>Gliem, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimodal+processing+of+olfactory+information+in+an+amphibian+nose:+odor+responses+segregate+into+a+medial+and+a+lateral+stream.">Bimodal processing of olfactory information in an amphibian nose: odor responses segregate into a medial and a lateral stream.</a> Cell. Mol. Life Sci. 70 (11), 1965-1984 (2013).</li><li>Hassenkl&#246;ver, T., Manzini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+wiring+logic+in+amphibians+challenges+the+basic+assumptions+of+the+unbranched+axon+concept.">Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept.</a> J. Neurosci. 33 (44), 17252-1710 (2013).</li><li>Bestman, J. E., Ewald, R. C., Chiu, S. -. L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+single-cell+electroporation+for+transfer+of+DNA+and+macromolecules.">In vivo single-cell electroporation for transfer of DNA and macromolecules.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1272-1210 (2006).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J., Nieuwkoop, P. 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Neurol. 481 (3), 233-239 (2005).</li><li>Nagayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+simultaneous+tracing+and+Ca2++imaging+of+local+neuronal+circuits.">In vivo simultaneous tracing and Ca2+ imaging of local neuronal circuits.</a> Neuron. 53 (6), 789-803 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La procédure expérimentale décrite ici permet l&#39;étiquetage des neurones sensoriels de l&#39;organe olfactif larvaire de X. laevis par électroporation de dextrans fluorophores couplés et la visualisation ultérieure de la croissance axonale sensorielle chez l&#39;animal vivant. En faisant varier les paramètres de l&#39;électroporation in vivo, il est possible de contrôler le nombre de neurones sensoriels marqués. Il est ainsi possible de marquer de grands groupes de neurones d&#39;un épithélium sensoriel, très peu ou même des cellules individuelles. Pour assurer le désire étendre l&#39;étiquetage des neurones, il est important d&#39;être particulièrement prudent sur les caractéristiques de micropipette et les impulsions d&#39;électroporation. Des résistances plus élevées et la réduction de l&#39;impulsion de tension d&#39;amplitude, la durée et le nombre de répétitions pipette peut réduire la quantité de cellules marquées, tandis que la diminution des résistances de pipette et supérieur amplitude d&#39;impulsion de tension, de durée et nombre d&#39;impulsions peut conduire à un étiquetage plus répandue. ThE à utiliser des dextrans fluorescents pour l&#39;électroporation fournit une rétroaction visuelle immédiate si les paramètres appliqués sont appropriés. Veillez à ce que l&#39;aide de paramètres pour l&#39;amplitude, la durée et le nombre d&#39;impulsions qui dépassent les valeurs indiquées dans le protocole peut potentiellement conduire à des dommages cellulaires ou même la mort cellulaire 17. Conseils bouchés ou brisés de micropipettes peuvent également entraver l&#39;électroporation réussie. En électroporation in vivo dans l&#39;organe olfactif de X. laevis est limitée aux stades larvaires depuis la peau de grenouille postmetamorphotic est difficile et ne peut pas être facilement pénétrée par une micropipette. La visualisation in vivo de processus neuronaux peut être entravé par la diffusion de la lumière d&#39;excitation / d&#39;émission dans les zones les plus profondes du cerveau ou de vaisseaux sanguins. Ce problème devient particulièrement évident dans les stades larvaires plus élevés en raison d&#39;un plus grand cerveau et peut conduire à des signaux bruyants rendant l&#39;identification claire des processus axonales fines plus difficile. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Permis Le protocole présenté à visualiser les neurones sensoriels du système olfactif intact sans disséquer l&#39;animal, endommager les cellules pendant l&#39;étiquetage, la préparation des tranches de tissu ou de fixer le tissu nécessaire pour des méthodes alternatives, comme l&#39;étiquetage dans le patch cellule entière expériences -clamp 18. En combinant l&#39;étiquetage de quelques simples ou neurones sensoriels avec in vivo laps de temps d&#39;imagerie, il est possible de visualiser les connexions glomérulaire des neurones sensoriels matures célibataires de plus longs intervalles de temps. De cette façon, il est également possible de suivre l&#39;évolution des modèles de projections axonales des neurones sensoriels immatures pendant plusieurs semaines. Cette dernière option est particulièrement intéressante car elle permet de surveiller les tendances d&#39;axones simples de croissance chez l&#39;animal vivant. Cela ouvre la possibilité d&#39;étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires qui contrôlent le guidage axonal et pathfinding. Plusieurs facteurs, y compris l&#39;expression du récepteur odorant, divers AxoIl a été démontré n molécules de guidage et induit odorant-/ activité spontanée des neurones sensoriels de réglementer la conclusion cible des axones des neurones sensoriels 4,5. L&#39;application du protocole ne se limite pas aux neurones sensoriels olfactifs, mais peut également être appliquée à l&#39;étude d&#39;autres types de cellules, par exemple., Les cellules souches / progénitrices neurogènes des zones du cerveau en développement ou cellules mitrales du bulbe olfactif. En outre, la technique illustrée peut également être utilisé en combinaison avec le calcium ou des dextranes sensibles injecté colorants de calcium membrane perméable à obtenir des informations sur le fonctionnement des neurones marqués et / ou les circuits connectés 7,19. La disponibilité d&#39;une large gamme de fluorophores couplés aux dextrans permet l&#39;étiquetage de plusieurs cellules ou populations de différentes couleurs individuelles. Aussi plasmide solution d&#39;ADN, par exemple codant pour des protéines fluorescentes, est adapté à l&#39;électroporation et peut en outre améliorer la versatiliTy et l&#39;utilité de la technique 6. Le protocole peut encore être amélioré pour permettre l&#39;électroporation combiné de dextrans et de l&#39;ADN ou morpholinos chargés de manipuler l&#39;expression des gènes 13,17. La méthode décrite représente certainement un nouvel outil pour étudier le processus complexe et pas encore pleinement compris qui régulent l&#39;orientation des axones dans le système olfactif des vertébrés.

The lifelong turnover of sensory neurons distinguishes the olfactory system from many other sensory and neuronal systems1,2. Newly formed sensory neurons are continuously generated in the basal portion of the olfactory epithelium3 and extend their axons into the olfactory bulb, the first relay station of the olfactory system4. However, the cellular and molecular mechanisms controlling the formation and maintenance of the olfactory map are far from being fully understood4,5.
Here, we describe a protocol for labeling sensory neurons of the olfactory organ of larval X. laevis by in vivo electroporation of fluorophore-coupled dextrans. The presented protocol allows visualization of axonal morphology and connectivity, track axonal development over time and study mechanisms regulating axonal wiring and guidance.
Electroporation is a well established method to introduce charged macromolecules, like dextran-coupled dyes and DNA, into cells6,7. The cell membrane is permeabilized by application of short voltage pulses and the molecules are electrophoretically delivered into the cytosol8. Spatially restricted electroporation using a micropipette permits selective labeling of cells including neurons and has been applied in various neuronal systems including the visual system of X. laevis9,10.
We show how the electroporated animals can be used to study axonal growth patterns and morphology in living animals using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. The described procedure allows identifying the coarse topology of axonal projections of sensory neurons of the main and accessory olfactory system11,12. Using in vivo time lapse imaging, it is also suitable to supervise the glomerular connections of single mature sensory neurons, and to monitor the evolution of the axonal projection patterns of immature sensory neurons12. The described protocol can be applied to investigate the structure and formation of olfactory circuits in the intact animal and can be adapted to other cell types within the olfactory and other neuronal systems.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="589">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:100px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">SZX16</td>
			<td style="width:100px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">stereomicroscope with fluorescent illumination</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Axon Axoporator 800A</td>
			<td style="width:100px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">single cell electroporator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">ELP-01D</td>
			<td style="width:100px;">npi electronic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">electroporator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">MMJ</td>
			<td style="width:100px;">M&#228;rzh&#228;user Wetzlar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">manual micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">P-1000</td>
			<td style="width:100px;">Sutter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Horizontal micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:203px;">G150F-4</td>
			<td style="width:100px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">glass capillaries for electroporation pipette fabrication; internal filament makes backfilling easier</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Alexa 488-dextran 10kD</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D22910</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Alexa 546-dextran 10kD</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D22911</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Alexa 568-dextran 10kD</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D22912</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Alexa 594-dextran 10kD</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D22913</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">TMR-dextran 3kD (micro-Ruby)</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D7162</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">microloader pipette tips</td>
			<td style="width:100px;">eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">930001007</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:203px;">tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td style="width:100px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E10521</td>
			<td style="width:167px;">anesthetic; use gloves</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">A1-MP</td>
			<td style="width:100px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">multiphoton microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">LSM 780</td>
			<td style="width:100px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Imaris</td>
			<td style="width:100px;">Bitplane</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">alternative software for neuronal tracing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the olfactory system as a model to study axonal growth patterns and morphology in vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

Le protocole décrit peut être appliquée avec succès pour l&#39;électroporation et la visualisation in vivo des processus axonales des neurones sensoriels du système olfactif de X. anesthésié laevis, en utilisant confocale à balayage laser ou par microscopie multiphotonique (figure 1). L&#39;électroporation permet dextrans fluorophore couplé à entrer et se propager rapidement à l&#39;intérieur des cellules de l&#39;organe olfactif. Il est utile d&#39;appliquer un éclairage fluorescent pour vérifier l&#39;étiquetage avec succès après le déclenchement d&#39;impulsions de tension. En fonction des paramètres d&#39;électroporation, par exemple., La résistance à la pipette, des groupes de cellules (figure 2A, B) ou des cellules individuelles (figure 2C) de l&#39;organe olfactif sont marqués. Les axones des neurones sensoriels marqués peuvent être visualisés dans le nerf olfactif (figure 2D) et les processus axonales peuvent être observés également dans le bulbe olfactif, généralement 24 heures après l&#39;électroporation réussie(Figure 3). L&#39;électroporation de groupes de neurones sensoriels permet de visualiser les motifs de câblage grossières dans le bulbe olfactif (figure 3A). Cellule unique électroporation peut être utilisée pour étudier les modèles individuels axonales de projection, bifurcations axonales et la connectivité aux structures glomérulaires dans le bulbe olfactif (figure 3C-E). Têtards albinos transparentes de X. permis de laevis dans confocale in vivo ou l&#39;imagerie multiphotonique des neurones sensoriels marqués dans le cerveau intact de têtard anesthésié. Le développement des modèles de croissance des axones peuvent être suivis sur plusieurs jours / semaines répétée dans la visualisation in vivo de la même neurone sensoriel marqué (figure 4). Selon la maturité du neurone sensoriel au point de l&#39;électroporation de temps le modèle de l&#39;axone dans le bulbe olfactif peut varier considérablement. Neurones matures possèdent déjà des branches axonales complexes qui comportent touffezones és connectés à des glomérules. Le modèle de croissance axonale des neurones matures est plutôt stable, mais l&#39;allongement de branches axonales et les raffinements de touffes glomérulaires sont observables (figure 4A-E). Les neurones sensoriels peuvent être observées in vivo pour des périodes de temps prolongées, par exemple., Plus de trois semaines (Figure 4F-I). D&#39;autre part, les axones des neurones immatures sont encore dans le processus de croissance initiale, ne possèdent pas arborisations touffus et ne sont pas encore connectés à leurs objectifs de glomérulaire finales. Le protocole expérimental permet de suivre le développement de ces neurones pendant la maturation, par exemple., Axone allongement, bifurcations et mise en place d&#39;arborisations tuftés (Figure 4J-L). Pour plus d&#39;exemples voir aussi Hassenklöver et Manzini 12. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig1highres.jpg" width="500"/&gt; Figure 1. Aperçu schématique du protocole expérimental. (A) des neurones sensoriels de l&#39;épithélium olfactif principal (MEO) ou de l&#39;organe voméronasal (VNO) de l&#39;organe olfactif de X. anesthésié larves laevis sont marqués par électroporation en utilisant une pipette en verre rempli d&#39;une solution de dextran fluorescent. Les axones des neurones marqués peuvent être suivies par le nerf olfactif (ON) et finissent par atteindre le bulbe olfactif (OB). (B) Le têtard est anesthésié et les neurones marqués sont étudiés à plusieurs reprises à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal ou multiphotonique dans des intervalles de temps spécifiques. (C) Le développement progressif des modèles de croissance des axones des cellules marquées peut être suivi sur des périodes de quelques jours ou semaines. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig2highres.jpg" width="500" /> Figure 2. Electroporation des neurones sensoriels de l&#39;organe olfactif. (A) électroporation avec des pipettes à faible résistance conduit à l&#39;étiquetage de plusieurs cellules dans l&#39;organe olfactif. Dans cet exemple, représentant de multiples neurones récepteurs olfactifs (NRO, des pointes de flèches pleines) et deux cellules cylindriques en forme de soutien (SC), astérisques ont été colorées. Les lignes pointillées délimitent les frontières de l&#39;épithélium olfactif (OE). (B) Affiner les paramètres d&#39;électroporation, par exemple., Augmentation de la résistance de la pipette, limite le nombre de cellules marquées. Dans cet exemple, un seul neurone sensoriel (têtes de flèches pleines) et une cellule adjacente de support (astérisque) ont été colorés après l&#39;électroporation. Notez l&#39;axone unique laissant l&#39;épithélium olfactif (têtes de flèches ouvertes). (C) réussie électroporation d&#39;une cellule unique conduit à l&#39;étiquetage exclusif d&#39;un neurone individuel sensorielle (tête de flèche rempli) et son axone connecté (têtes de flèches ouvertes) dans l&#39;épithélium olfactif. <strong&gt; (D) L&#39;axone marqué unique (flèches ouvertes) peut être suivie par le nerf olfactif (ON) dans le bulbe olfactif. <img alt="Figure 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig3highres.jpg" width="400" /> Figure 3. La visualisation des projections axonales olfactifs dans le bulbe olfactif excisé. (A) La topologie grossière de projections axonales de neurones sensoriels dans le bulbe olfactif peut être visualisé en utilisant des pipettes inférieurs d&#39;électroporation de résistance. Un hémisphère bulbe olfactif et son nerf olfactif associé (ON) sont représentés. Quatre dextrans couplés à des fluorophores différents électroporation à quatre endroits éloignés de l&#39;organe olfactif: latérale (vert), intermédiaire (jaune), médial ME (rouge) et VNO (orange). Cela permet de visualiser l&#39;ampoule olfactive accessoire (AOB) et les trois principaux domaines de la principale bulbe olfactif (MOB) de projection. <strong&gt; (B) Différents modèles de croissance des axones des neurones sensoriels olfactifs individuelles superposées sur la structure du bulbe olfactif. Représentées sont (CE) Exemples d&#39;axones olfactifs projection unique dans le bulbe olfactif et formant tuftés arborisations / synapses dans les glomérules sphérique (têtes de flèches pleines) combiné trois reconstructions tridimensionnelles de multiples colorations de cellules isolées provenant de différents spécimens de larves.. On notera que dans X. laevis axones olfactifs bifurquent régulièrement (flèches ouvertes) avant la connexion à un, deux ou plusieurs glomérules (pointes de flèches remplies, vous pouvez aussi Hassenklöver et Manzini 12). <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig4highres.jpg" width="500" /> Figure 4. In vivo imagerie time-lapse de simples axones des neurones olfactifs. (AE)Après avoir réussi électroporation de cellules individuelles de l&#39;axone marqué peut être visualisé de manière répétée dans le bulbe olfactif (OB). Cet exemple montre un axone individu qui a été étudié pendant une semaine. La morphologie globale ne change pas considérablement et deux points de ramification principaux peut être identifié (têtes de flèche vides). Notez que dans le cours du temps, une touffe glomérulaire subit une réduction continue (tête de flèche rempli), tandis que les deux autres touffes glomérulaires restent stables (astérisques). (FI) Cet exemple représentatif montre la viabilité d&#39;observations à long terme comme a enquêté sur cet axone spécifique pendant plus de trois semaines. Pas de changement visible de son profil de croissance peut être détectée. (JL) Un exemple d&#39;un axone sensoriel immature dans le processus de croissance est représentée. Il n&#39;a pas encore relié à des glomérules et des touffes glomérulaires caractéristiques sont portées disparues. Après 5 jours, les branches axonales sont allongées, l&#39;axone bifurqué plusieurs fois et arborisations fines sontétabli.

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The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Le système olfactif comme un modèle pour étudier des modèles axonale croissance et la morphologie<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

10.8K vues.  University of Göttingen. We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

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A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Système modèle pour l&#39;étude de Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Recherche

Neurosciences

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulation génétique des neurones du cervelet granules<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em&gt; À étudier neuronale Morphologie et migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo préparatifs de l&#39;ampoule Vomeronasal organes et accessoire olfactive Intact

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

A Free-breathing fMRI Method to Study Human Olfactory Function

The study of human olfaction is a highly complex and valuable field with applications ranging from biomedical research to clinical evaluation. Currently, evaluation of the functions of the human central olfactory system with functional magnetic resonance imaging (fMRI) is still a challenge because of several technical difficulties. There are some significant variables to take into account when considering an effective method for mapping the function of the central olfactory system using fMRI, including proper odorant selection, the interaction between odor presentation and respiration, and potential anticipation of or habituation to odorants. An event-related, respiration-triggered olfactory fMRI technique can accurately administer odorants to stimulate the olfactory system while minimizing potential interference. It can effectively capture the precise onsets of fMRI signals in the primary olfactory cortex using our data post-processing method. The technique presented here provides an efficient and practical means for generating reliable olfactory fMRI results. Such a technique can ultimately be applied in the clinical realm as a diagnostic tool for diseases associated with olfactory degeneration, including Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s disease, as we begin to further understand the complexities of the human olfactory system.

We present the technical challenges and solutions for obtaining reliable functional magnetic resonance imaging (fMRI) data from the human central olfactory system. This includes special considerations in olfactory fMRI paradigm design, descriptions of fMRI data acquisition with an MRI-compatible olfactometer, odorant selection, and a special software tool for data post-processing.

Une méthode FMRI à respiration libre pour étudier la fonction olfactive humaine

The study of human olfaction is a highly complex and valuable field with applications ranging from biomedical research to clinical evaluation. Currently, ...

Facial Nerve Surgery in the Rat Model to Study Axonal Inhibition and Regeneration

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial nerve can be manipulated along its entire length, from its intracranial segment to its extratemporal course. There are three primary types of nerve injury used for the experimental study of regenerative properties: nerve crush, transection, and nerve gap. The range of possible interventions is vast, including surgical manipulation of the nerve, delivery of neuroactive reagents or cells, and either central or end-organ manipulations. Advantages of this model for studying nerve regeneration include simplicity, reproducibility, interspecies consistency, reliable survival rates of the rat, and an increased anatomic size relative to murine models. Its limitations involve a more limited genetic manipulation versus the mouse model and the superlative regenerative capability of the rat, such that the facial nerve scientist must carefully assess time points for recovery and whether to translate results to higher animals and human studies. The rat model for facial nerve injury allows for functional, electrophysiological, and histomorphometric parameters for the interpretation and comparison of nerve regeneration. It thereby boasts tremendous potential toward furthering the understanding and treatment of the devastating consequences of facial nerve injury in human patients.

This protocol describes a reproducible approach to facial nerve surgery in the rat model, including descriptions of various inducible patterns of injury.

Chirurgie du nerf facial dans le modèle de rat pour étudier l’inhibition et la régénération axonales

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

Génération d'hydrogels à base de collagène 3D pour analyser la croissance et le comportement axonal pendant le développement du système nerveux

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory bulb. Throughout adult life, they are key for axonal growing of newly generated olfactory neurons, from the lamina propria to the ONL. Due to their pro-regenerative properties, these cells have been used to foster axonal regeneration in spinal cord or optic nerve injury models.
We present an in vitro model to assay and measure OEG neuroregenerative capacity after neural injury. In this model, reversibly immortalized human OEG (ihOEG) is cultured as a monolayer, retinas are extracted from adult rats and retinal ganglion neurons (RGN) are cocultured onto the OEG monolayer. After 96 h, axonal and somatodendritic markers in RGNs are analyzed by immunofluorescence and the number of RGNs with axon and the mean axonal length/neuron are quantified.
This protocol has the advantage over other in vitro assays that rely on embryonic or postnatal neurons, that it evaluates OEG neuroregenerative properties in adult tissue. Also, it is not only useful for assessing the neuroregenerative potential of ihOEG but can be extended to different sources of OEG or other glial cells.

We present an in vitro model to assess olfactory ensheathing glia (OEG) neuroregenerative capacity, after neural injury. It is based on a coculture of axotomized adult retinal ganglion neurons (RGN) on OEG monolayers and subsequent study of axonal regeneration, by analyzing RGN axonal and somatodendritic markers.

Coculture de neurones rétiniens axotomisés de ganglion de rat avec glia ensheathing olfactif, comme modèle in vitro de régénération axonale adulte

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent cerebellum is an ideal system to track the development and morphogenesis of a single cell type, the cerebellar granule neuron (CGN), across time. Here, in vivo electroporation of granule neuron progenitors in the developing mouse cerebellum was employed to sparsely label cells for subsequent morphological analyses. The efficacy of this technique is demonstrated in its ability to showcase key developmental stages of CGN maturation, with a specific focus on the formation of dendritic claws, which are specialized structures where these cells receive the majority of their synaptic inputs. In addition to providing snapshots of CGN synaptic structures&#160;throughout cerebellar development, this technique can be adapted to genetically manipulate granule neurons in a cell-autonomous manner to study the role of any gene of interest and its effect on CGN morphology, claw development, and synaptogenesis.

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Here we describe a method to visualize synaptogenesis of granule neurons in the mouse cerebellum over the time course of postnatal brain development when these cells refine their synaptic structures and form synapses to integrate themselves into the overall brain circuit.

Utilisation de l’électroporation postnatale in vivo pour étudier la morphologie des neurones cérébelleux granulaires et le développement des synapses

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent ...

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in retinal diseases, and testing therapeutic interventions. The ex vivo electroretinogram (ERG) allows the quantification of contributions from individual cell types in the isolated retina by addition of specific pharmacological agents and evaluation of tissue-intrinsic changes independently of systemic influences. Retinal light responses can be measured using a specialized ex vivo ERG specimen holder and recording setup, modified from existing patch clamp or microelectrode array equipment. Particularly, the study of ON-bipolar cells, but also of photoreceptors, has been hampered by the slow but progressive decline of light responses in the ex vivo ERG over time. Increased perfusion speed and adjustment of the perfusate temperature improve ex vivo retinal function and maximize response amplitude and stability. The ex vivo ERG uniquely allows the study of individual retinal neuronal cell types. In addition, improvements to maximize response amplitudes and stability allow the investigation of light responses in retina samples from large animals, as well as human donor eyes, making the ex vivo ERG a valuable addition to the repertoire of techniques used to investigate retinal function.

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Modification of existing multielectrode array or patch clamp equipment makes the ex vivo electroretinogram more widely accessible. Improved methods to record and maintain ex vivo light responses facilitate the study of photoreceptor and ON-bipolar cell function in the healthy retina, animal models of eye diseases, and human donor retinas.

Optimisation de la configuration et des conditions de l’électrorétinogramme ex vivo pour étudier la fonction de la rétine dans les petits et grands yeux

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones -the sensory structures located at the distal tips of developing axons- execute this process. Studying the structure and dynamics of the growth cone is crucial to understanding axonal development and the interactions with the surrounding central nervous system (CNS) that enable it to form neural circuits. This is essential when devising methods to reintegrate axons into neural circuits following injury in fundamental research and pre-clinical contexts. Thus far, the general understanding of growth cone dynamics is primarily founded on studies of neurons cultured in two dimensions (2D). Although undoubtedly fundamental to the current knowledge of growth cone structural dynamics and response to stimuli, 2D studies misrepresent the physiological three-dimensional (3D) environment encountered by neuronal growth cones in intact CNS tissue. More recently, collagen gels were employed to overcome some of these limitations, enabling the investigation of neuronal development in 3D. However, both synthetic 2D and 3D environments lack signaling cues within CNS tissue, which direct the extension and pathfinding of developing axons. This protocol provides a method for studying axons and growth cones using organotypic brain slices, where developing axons encounter physiologically relevant physical and chemical cues. By combining fine-tuned in utero and ex utero electroporation to sparsely deliver fluorescent reporters along with super-resolution microscopy, this protocol presents a methodological pipeline for the visualization of axon and growth cone dynamics in situ. Furthermore, a detailed toolkit description of the analysis of long-term and live-cell imaging data is included.

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

This protocol demonstrates a straightforward and robust method to study in situ axon growth and growth cone dynamics. It describes how to prepare ex vivo physiologically relevant acute brain slices and provides a user-friendly analysis pipeline.

In situ Visualisation de la croissance des axones et de la dynamique des cônes de croissance dans des cultures de tranches cérébrales embryonnaires ex vivo aiguës

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...