Nous remercions Shao-Ming Lu et Harris A. Gelbard pour l&#39;utilisation d&#39;une pompe péristaltique et vibratome, ainsi que Karen L. Bentley et Gayle Schneider au Core Facility microscope électronique à la recherche de l&#39;Université de Rochester Medical Center de l&#39;assistance technique. Ce travail a été financé par des subventions du NIH (EY019277), Whitehall Fondation Burroughs Wellcome Fund et la Fondation Alfred P. Sloan pour AKM. M.-È.T. est financé par un Fonds de recherche en santé du Québec (FRSQ) de bourses de formation postdoctorale.

1. Perfusion des animaux <ol><li> Le jour avant la perfusion, préparer: - 2 L de tampon phosphate (PB; 100 mM, pH 7,4) et 1 L de sodium tampon phosphate salin (PBS, 0,9% de NaCl dans 50 mM de PB, pH 7,4) dans de l&#39;eau bidistillée. Stocker le PBS et 1L de PB à 4 ° C. Ils seront utilisés pour la perfusion et de pré-enrobage immunocytochimie. - 1L de 4,0% paraformaldéhyde (PFA, pH 7,4) la solution de fixation, ce qui permettra à la perfusion de 6 souris. À cette fin, la chaleur jusqu&#39;à 1 L de PB sous une hotte. Peser 40 g de paraformaldéhyde granulaire (PFA) et verser dans la solution PB quand elle atteint 60 ° C. Quand la solution est claire, avec l&#39;IFP complètement dissous, refroidir à température ambiante (RT) et stocker à 4 ° C. </li><li> Le jour de la perfusion, préparer 500 ml de solution d&#39;acroléine de 3,5% en PB sous une hotte. Ensuite, filtrer les 3,5% d&#39;acroléine et de 4,0% en utilisant des solutions PFA papier filtre. </li><li> Pour l&#39;anesthésie de la souris, injecter du pentobarbital sodique (80 mg / kg) dans le péritoine avec une jauge de 27 ½ &quot;aiguille. </li><li> Pendant la perfusion, 50 ml de PBS, 75 ml d&#39;acroléine, et 150 ml de PFA seront séquentielle passent dans la circulation de la souris. Pour configurer la pompe péristaltique, remplir le tube avec du PBS et de fixer une jauge 23 ¾ &quot;aiguille à ailettes à une extrémité. Plongez l&#39;autre extrémité du tube dans la solution de perfusion (PBS, l&#39;acroléine ou PFA). Régler la vitesse de la péristaltique Pompe à 20-25 ml / min pour les souris adultes et juvéniles. Tout au long de la perfusion, soigneusement éviter toute formation de bulles d&#39;air dans le tube. </li><li> Attendez jusqu&#39;à ce que la souris anesthésiée ne répond plus aux stimuli douloureux, comme un pincement de la queue, avant de procéder. Lay de l&#39;animal dans un bac de dissection et de fixer les pattes avec du ruban. Avec une pince à épiler, ciseaux, ouvrir la peau et la cavité thoracique afin d&#39;exposer le cœur. Afin de minimiser l&#39;ischémie cérébrale, la perfusion doit être lancé rapidement. Couper l&#39;oreillette droite avec de petits ciseaux et de démarrer la pompe péristaltique. Tout en maintenant le cœur avec des pincettes, insérer l&#39;aiguille papillon dans la pointe du ventricule gauche. </li><li> Lors du changement de solution, arrêter la pompe péristaltique, le transfert du tube d&#39;une solution à l&#39;autre, et de redémarrer la pompe immédiatement. </li><li> Lorsque 150 ml de PFA est passé, arrêter la pompe péristaltique. L&#39;utilisation de petits ciseaux, couper la tête, ouvrez la peau, et de briser le crâne entre les yeux. Utiliser des petites pinces, soigneusement puce petits morceaux de crâne jusqu&#39;à ce que le cerveau peut être facilement enlevés. Post-fix du cerveau pendant 2 heures à 4 ° C en PFA. Lavez 3 fois 10 minutes dans du PBS. </li><li> La coupure immédiate du cerveau dans transversale (50 sections um d&#39;épaisseur) dans la glace refroidi par PBS en utilisant un vibratome. Avec un pinceau fin, le transfert des sections choisies pour immunocytochimie dans un flacon en verre contenant du PBS. Stocker les sections restantes à -20 ° C dans un cryoprotecteur (30% d&#39;éthylène glycol et du glycérol 30% dans PBS) pendant jusqu&#39;à plusieurs années. </li></ol> 2. Pré-enrobage immunocytochimie <ol><li> Pour l&#39;immunocytochimie, les sections sont traitées flottant librement dans des flacons en verre. Tout au long de la procédure, on doit soigneusement éviter de laisser sécher les sections. </li><li> Tout d&#39;abord, retirer le CPE à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert et de remplacer immédiatement avec une solution fraîche de borohydrure de sodium à 0,1% dans PBS pendant 30 minutes à température ambiante. </li><li> Rincer avec du PBS sections 3 fois 10 minutes, enlever toutes les bulles, et incuber pendant 2 heures à température ambiante dans une solution de blocage de PBS contenant 0,5% de gélatine et de 5% de sérum normal de l&#39;animal dans lequel l&#39;anticorps secondaire a été généré (sérum de chèvre normal dans le présent exemple de Iba1-immunomarquage). </li><li> Incuber pendant 48 heures avec l&#39;anticorps primaire dans une solution de blocage. Pour Iba1-immunomarquage, l&#39;utilisation de lapin anti-Iba1 d&#39;anticorps (1:1000). </li><li> Rincer avec du PBS sections 3 fois 10 minutes et incuber en anticorps secondaire conjugué à la biotine (1:1000) dans une solution de blocage pendant 2 heures à température ambiante. Pour Iba1-immunomarquage, l&#39;utilisation de chèvre anti-IgG de lapin. </li><li> Rincer avec du PBS sections 3 fois 10 minutes et incuber dans streptavidine-peroxydase de raifort (1:1000) dans une solution de blocage pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Rincer avec du PBS sections 10 minutes et avec du Tris / HCl solution saline tamponnée (SCT; 50 mM, pH 7,4) 2 fois 10 minutes. Pour révéler l&#39;étiquetage, incuber sections avec DAB 0,05% et 0,01% de peroxyde d&#39;hydrogène dans du TBS (solution fraîchement préparée). Lorsque la coloration est brun foncé (voir exemple en figure 1), arrêter la réaction en rinçant au SCT. En tout cas, la fin de la réaction après un maximum de 5 minutes. Rincer les sections avec le SCT 10 minutes et avec PB 2 fois 10 minutes. </li></ol> 3. Traitement pour la microscopie électronique <ol><li> Transfert sections en PB dans une plaque de culture multipuits en utilisant un pinceau fin. Préparer une solution de tétroxyde d&#39;osmium% de PB sous une hotte fumant. Retirer PB provenant des puits de la plaque de culture et<html> répandre les sections planes avec un pinceau fin. Immédiatement sections plonger dans osmium à 1% pendant 30 minutes à température ambiante. </li><li> Transfert des sections dans des flacons en verre, rincez avec PB 3 fois 10 minutes, et déshydrater grâce à des immersions dans les deux minutes ascendante concentrations d&#39;éthanol: 2 fois 35%, une fois chacun de 50%, 70%, 80%, 90%, et 95 %, 3 fois à 100%, suivie par l&#39;oxyde de propylène 3 fois. </li><li> Pour préparer la résine Durcupan, mélanger 20 g de composant A, 20 g de composant B, 0,6 g de composant C, et 0,4 g du composant D dans un bécher jetable, bien mélanger jusqu&#39;à ce que la couleur devient uniforme, et versez-le dans une boîte en aluminium pèsent plat. Si nécessaire, des blocs de résine peuvent être préparés par coulage de résine dans les moules et les intégrer dans un four de séchage à 55 ° C pendant 48-72 heures. </li><li> Utiliser une brosse fine rincés à l&#39;oxyde de propylène, enlever les sections de l&#39;oxyde de propylène et plonger dans la résine d&#39;imprégnation Durcupan nuit à TA. </li><li> Le lendemain, mettre de l&#39;aluminium pèsent plat dans un four à 55 ° C pendant 10 minutes pour ramollir la résine. Avec un pinceau rincés à l&#39;oxyde de propylène, le manteau d&#39;un film intégrant ACLAR avec une fine couche de résine, de fixer les sections, couvrir avec un autre film d&#39;enrobage, et à répartir uniformément les poids légers (environ 2 g, par exemple les bouchons en plastique des flacons en verre) sur le dessus pour aider à répandre la résine. Pour la polymérisation de résine, incuber dans le four pendant 48-72 heures (à 55 ° C). </li><li> Après polymérisation, enlever les poids légers et le film intégrant sur le dessus des sections. Sous un microscope binoculaire, sélectionner des zones d&#39;intérêt carrés (environ 2x2 mm) et soigneusement les exciser du film en utilisant une lame de rasoir. </li><li> Collez les domaines d&#39;intérêt, à la pointe de blocs de résine à l&#39;aide Superglue et guérir dans le four à 55 ° C pendant 1 heure. </li><li> En préparation pour la coupe, coupez le bloc de résine à la forme d&#39;un trapèze isocèle avec une lame de rasoir. </li><li> Utiliser un ultramicrotome et un couteau de verre, enlever la colle et la résine à la surface du tissu. Remplissez le bateau du couteau en verre avec de l&#39;eau bidistillée et couper quelques coupes semi-fines (0,5-1 um d&#39;épaisseur). </li><li> Transfert des sections à une diapositive SuperFrost avec une boucle parfaite. Sécher les sections en plaçant la lame sur une plaque chauffante à 80 ° C pendant 1 minute. Couvrir avec quelques gouttes de bleu de toluidine 0,1% tache (2 g de borate de sodium et 0,2 g de bleu de toluidine dans 200 ml d&#39;eau bidistillée) pendant 1 minute. Rincez la tache avec de l&#39;excès d&#39;eau bidistillée. L&#39;examen des parties avec un microscope optique permettra de distinguer les tissus colorés de la résine (figure 2). </li><li> Reprendre la coupe jusqu&#39;à la frontière entre le tissu et la résine atteint le milieu des sections. Notez que la procédure suivante nécessite une formation. Remplacer le couteau en verre avec un couteau de diamant et de remplir le bateau à l&#39;eau bidistillée. Couper l&#39;argent à des coupes ultrafines argent-or (60-80 nm d&#39;épaisseur) et soigneusement les recueillir sur les grilles de mailles fines cuivre en utilisant une pince à épiler inversé. Sécher les grilles sur un papier filtre. </li><li> Pour améliorer le contraste, coupes ultrafines peuvent être colorées avec du citrate de plomb (0,03 g citrate de plomb et 0,1 ml d&#39;hydroxyde de sodium 10N dans 10 ml d&#39;eau bidistillée 1). En utilisant une pince à épiler fines inversé, le transfert d&#39;une grille à une baisse de citrate de plomb pendant 2 minutes. Retirez délicatement la grille et rincer à trois bains successifs d&#39;eau bidistillée. Enfin, sécher les grilles sur un papier filtre et rangez-les dans une boîte de grille jusqu&#39;à examen au microscope électronique (Figures 3-6). </li></ol> 4. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Iba1 teinté section au niveau de lumière microscopiques. La distribution cellulaire des Iba1 est limitée à la microglie, qui montre la spécificité de l&#39;immunomarquage. Barre d&#39;échelle = 100 pm. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Toluidine colorées en bleu semi-fines section au niveau de lumière microscopiques. Notez la frontière entre le tissu et résine où l&#39;immunomarquage apparaîtra plus intense au microscope électronique. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Section ultrafine montrant Iba1-immunopositives péricaryon microgliales et les processus au niveau microscope électronique. Iba1 positifs des éléments de structure sont reconnus par leurs immunoperoxydase-DAB denses aux électrons précipité. Barre d&#39;échelle = 2 um. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Ultrathin la section affichant Iba1-immunopositives processus microgliales de tailles et de formes différentes au niveau microscope électronique. Barre d&#39;échelle = 2 um. e 5 &quot;/&gt; Figure 5. Ultraminces montrant la section au plus fort grossissement d&#39;un processus positif Iba1 microgliales de la figure 4, permettant l&#39;identification de ses organites intracellulaires. Barre d&#39;échelle = 1 um. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig6.jpg" alt="Figure 6" /> Figure 6. Section ultrafine révélant au plus fort grossissement les relations entre un processus ultrastructurale Iba1 positif microgliales et des éléments proches du neuropile dont les synapses. Barre d&#39;échelle = 1 um.

<ol>
	<li>Venable, J. H., Coggeshall, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+lead+citrate+stain+for+use+in+electron+microscopy.">A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).</li><li>Riad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatodendritic+localization+of+5-HT1A+and+preterminal+axonal+localization+of+5-HT1B+serotonin+receptors+in+adult+rat+brain.">Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain.</a> J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).</li><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+EphA4+in+axon+terminals+and+dendritic+spines+of+adult+rat+hippocampus.">Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).</li><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+course+of+EphA4+cellular+and+subcellular+localization+in+the+postnatal+rat+hippocampus.">Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).</li><li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-synaptic+and+post-synaptic+localization+of+EphA4+and+EphB2+in+adult+mouse+forebrain.">Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain.</a> J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).</li><li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA4+is+localized+in+clathrin-coated+and+synaptic+vesicles+in+adult+mouse+brain.">EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain.</a> J Neurochem. , (2010).</li></ol>

Ici, nous avons décrit un protocole de préparation de tissu cérébral de souris pour immunoélectromicroscopie qui offre un excellent compromis entre la préservation ultrastructurale et la détection optimales immunocytochimiques, lorsque les procédures sont rigoureusement exécutée. Combiné avec la TEM, cette méthode permet de distinguer les éléments cellulaires avec peu de traits distinctifs et les critères d&#39;identification. En particulier, la coloration immunoperoxydase-DAB...

* On doit toujours travailler sous une hotte et porter des gants en nitrile lorsque vous manipulez l&#39;acroléine, le paraformaldéhyde, et l&#39;osmium et devrait également disposer de leurs déchets de façon appropriée.

preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy

Microscopie électronique à transmission (MET) est extrêmement utile pour la visualisation de la microglie, oligodendrogliome, astrocytaire, et neuronale compartiments subcellulaires (dendrites, épines dendritiques, axone, axone terminal, péricaryon), ainsi que leurs organites intracellulaires et du cytosquelette, dans le système nerveux central à haute résolution spatiale. Combiné avec la TEM, pré-enrobage immunocytochimie permet la discrimination des éléments cellulaires avec peu de traits distinctifs et les critères d&#39;identification (par exemple, microgliales péricaryon et des processus, en utilisant un anticorps dirigé contre le marqueur spécifique à la microglie Iba1 (ionisé molécule adaptatrice une fixation du calcium; tel que présenté ici)), en identifiant le contenu neurotransmetteur des éléments cellulaires (par exemple, sérotoninergiques) et leur localisation ultrastructurale des protéines solubles ou membranaires (par exemple, 5 HT1A et EphA4 récepteurs). Ici, nous décrivons un protocole pour perfusion transcardiaque de souris avec l&#39;acroléine fixateur, l&#39;enlèvement et le sectionnement du cerveau, ainsi que l&#39;immunoperoxydase-diaminobenzidine (DAB) coloration, résine d&#39;enrobage, et ultraminces de sectionnement des sections du cerveau. A l&#39;issue de ces procédures, le matériel est prêt immunocolorés pour examen avec le TEM. Lorsque rigoureusement exécutée, cette technique fournit un excellent compromis entre la préservation ultrastructurale et la détection optimales immunocytochimiques.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy at JoVE.com

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Nous décrivons un protocole pour perfusion transcardiaque de souris, l&#39;enlèvement et la coupe du cerveau, ainsi que la coloration immunoperoxydase, résine d&#39;enrobage, et ultraminces de sectionnement des sections du cerveau. A l&#39;issue de ces procédures, le matériel est prêt pour immunocolorés examen par microscopie électronique à transmission.

Préparation du tissu cérébral de souris pour microscopie électronique

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

preparation-of-mouse-brain-tissue-for-immunoelectron-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

36.7K vues.  University of Rochester. Nous décrivons un protocole pour perfusion transcardiaque de souris, l'enlèvement et la coupe du cerveau, ainsi que la coloration immunoperoxydase, résine d'enrobage, et ultraminces de sectionnement des sections du cerveau. A l'issue de ces procédures, le matériel est prêt pour immunocolorés examen par microscopie électronique à transmission.

Vidéo: Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

Ion Beam ciblée de fraisage et de microscopie électronique à balayage du tissu cérébral

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Recherche

Neurosciences

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Microscopie multiphotonique de cerveau de souris Effacé Exprimant YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Résolution tomographie optique de cerveaux de souris entières avec Feuille confocale microscopie optique Micron-échelle de

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulation génétique des neurones du cervelet granules<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em&gt; À étudier neuronale Morphologie et migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Le système olfactif comme un modèle pour étudier des modèles axonale croissance et la morphologie<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Préparation du Primat tissu cérébral non humain pour immunohistochimie pré-enrobage et microscopie électronique

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Combined Mechanical and Enzymatic Dissociation of Mouse Brain Hippocampal Tissue

This neural dissociation protocol (an adaptation of the protocol accompanying a commercial adult brain dissociation kit) optimizes tissue processing in preparation for detailed downstream analysis such as flow cytometry or single-cell sequencing. Neural dissociation can be conducted via mechanical dissociation (such as using filters, chopping techniques, or pipette trituration), enzymatic digestion, or a combination thereof. The delicate nature of neuronal cells can complicate efforts to obtain the highly viable, true single-cell suspension with minimal cellular debris that is required for single-cell analysis. The data demonstrate that this combination of automated mechanical dissociation and enzymatic digestion consistently yields a highly viable (&gt;90%) single-cell suspension, overcoming the aforementioned difficulties. While a few of the steps require manual dexterity, these steps lessen sample handling and potential cell loss. This manuscript details each step of the process to equip other laboratories to successfully dissociate small quantities of neural tissue in preparation for downstream analysis.

This neural cell dissociation protocol is intended for samples with a low amount of starting material and yields a highly viable single-cell suspension for downstream analysis, with optional fixation and staining steps.

Dissociation mécanique et enzymatique combinée du tissu hippocampique du cerveau de la souris

This neural dissociation protocol (an adaptation of the protocol accompanying a commercial adult brain dissociation kit) optimizes tissue processing in ...

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo imaging with subcellular resolution. 3PM has two major advantages for deep-tissue imaging over 2PM that has been widely used in biology laboratories: (i) longer attenuation length in scattering tissues by employing ~1,300 nm or ~1,700 nm excitation laser; (ii) less background fluorescence generation due to higher-order nonlinear excitation. As a result, 3PM allows high-contrast structural and functional imaging deep within scattering tissues such as intact mouse brain from the cortical layers to the hippocampus and the entire forebrain of adult zebrafish.
Today, laser sources suitable for 3PM are commercially available, enabling the conversion of an existing two-photon (2P) imaging system to a three-photon (3P) system. Additionally, multiple commercial 3P microscopes are available, which makes this technique readily available to biology research laboratories. This paper shows the optimization of a typical 3PM setup, particularly targeting biology groups that already have a 2P setup, and demonstrates intravital 3D imaging in intact mouse and adult zebrafish brains. This protocol covers the full experimental procedure of 3P imaging, including microscope alignment, prechirping of ~1,300 and ~1,700 nm laser pulses, animal preparation, and intravital 3P fluorescence imaging deep in adult zebrafish and mouse brains.

Three-photon microscopy enables high-contrast fluorescence imaging deep in living biological tissues, such as mouse and zebrafish brains, with high spatiotemporal resolution.

Microscopie à fluorescence à trois photons des tissus profonds dans le cerveau intact d’une souris et d’un poisson-zèbre

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of structural changes caused by genetic or environmental perturbations. Whole-brain imaging results in more accurate quantification of cells and the study of region-specific differences that may be missed with commonly used microscopy of physically sectioned tissue. Using light-sheet microscopy to image cleared brains greatly increases acquisition speed as compared to confocal microscopy. Although these images produce very large amounts of brain structural data, most computational tools that perform feature quantification in images of cleared tissue are limited to counting sparse cell populations, rather than all nuclei.
Here, we demonstrate NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), a group of analysis tools, to quantify all nuclei and nuclear markers within annotated regions of a postnatal day 4 (P4) mouse brain after clearing and imaging on a light-sheet microscope. We describe magnetic resonance imaging (MRI) to measure brain volume prior to shrinkage caused by tissue clearing dehydration steps, tissue clearing using the iDISCO+ method, including immunolabeling, followed by light-sheet microscopy using a commercially available platform to image mouse brains at cellular resolution. We then demonstrate this image analysis pipeline using NuMorph, which is used to correct intensity differences, stitch image tiles, align multiple channels, count nuclei, and annotate brain regions through registration to publicly available atlases.
We designed this approach using publicly available protocols and software, allowing any researcher with the necessary microscope and computational resources to perform these techniques. These tissue clearing, imaging, and computational tools allow measurement and quantification of the three-dimensional (3D) organization of cell-types in the cortex and should be widely applicable to any wild-type/knockout mouse study design.

This protocol describes methods for conducting magnetic resonance imaging, clearing, and immunolabeling of intact mouse brains using iDISCO+, followed by a detailed description of imaging using light-sheet microscopy, and downstream analyses using NuMorph.

Imagerie unicellulaire du cerveau entier et analyse de cerveaux de souris néonatales intactes à l’aide de l’IRM, du nettoyage des tissus et de la microscopie à feuille de lumière

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

Imagerie calcique à deux photons et à grand champ dans le colliculus supérieur

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

Pleins feux sur l’auteur : Dévoilement du codage neuronal et des mécanismes de traitement visuel dans le colliculus supérieur 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

Imagerie calcique dans le colliculus supérieur de souris

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...