Cette étude a été soutenue par un en sciences naturelles et en génie du Canada de subvention (CRSNG) de recherche et un ministère de l&#39;Agriculture Financement Consortium accorder à la DRB. AMR est soutenu par une bourse CRSNG Vanier canadien des études supérieures, Université de l&#39;Alberta et assistanat à l&#39;enseignement une reine Elizabeth II bourses d&#39;études supérieures.

Cette procédure peut être effectuée dans 500 ul des tubes siliconés ou 6 ml en polystyrène à fond rond tubes FACS. Ce dernier est normalement utilisée lors de la réalisation d&#39;analyses de viabilité en conjonction avec d&#39;autres procédures. Tous les volumes sont donnés à 6 ml tubes en polystyrène FACS à fond rond. Pour 500 ul des tubes siliconés, de réduire l&#39;ensemble des volumes de 1 / 5. La concentration optimale pour l&#39;analyse de cytométrie en flux est de 2-4 x 10 6 cellules par 200 le volume ul. La perte de cellules peuvent résulter de cette procédure et donc nous recommandons que chaque échantillon se compose de 4 x 10 6 cellules au début de la procédure. 1. Préparation des cellules <ol><li> Récolte des cellules - se référer à des procédures spécifiques pour les lignées de cellules correspondant ou des isolations de cellules primaires. </li><li> Centrifuger les échantillons à 335 x g pendant 10 minutes et décanter le surnageant. </li><li> Resuspendre les cellules dans 2 ml de phosphate 1 x saline tamponnée (PBS) - / - (pas de calcium, de magnésium aucune). </li><li> Centrifuger les échantillons à 335 x g pendant 10 minutes et décanter le surnageant. </li><li> Resuspendre les cellules dans 1 ml de tampon 1 x V annexine contraignant. </li><li> Centrifuger les échantillons à 335 x g pendant 10 minutes et décanter le surnageant. </li><li> Resuspendre les cellules dans 100 ul de tampon 1 x V annexine contraignant. </li></ol> 2. Application de l&#39;annexine V / PI Stain <ol><li> Ajouter annexine V, conformément aux recommandations du fabricant [par exemple, 5 uL annexine V Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, A13201)]. </li><li> Incuber les tubes dans l&#39;obscurité pendant 15 minutes à température ambiante. </li><li> Ajouter 100 ul d&#39;une mémoire tampon annexine V x contraignant pour chaque tube de réaction. Il devrait y avoir environ 200 uL dans chaque tube. </li><li> Ajouter 4 pi de PI (Sigma, Cat # P-4864-10 ml) qui a été diluée à 1:10 dans une mémoire tampon annexine V x contraignant (1 PI uL avec 9 x 1 ul annexine V tampon de liaison). Cela produira une concentration finale de PI 2 ug / ml dans chaque échantillon. </li><li> Incuber les tubes dans l&#39;obscurité pendant 15 minutes à température ambiante. </li><li> Ajouter 500 ul 1 x annexine V tampon de liaison pour laver les cellules. </li><li> Centrifuger les échantillons à 335 x g pendant 10 minutes et décanter le surnageant. </li><li> Resuspendre les cellules dans 500 ul de tampon 1 x V annexine contraignant et 500 uL de formaldéhyde à 2% pour créer une solution à 1% de formaldéhyde (fixateur). Mélanger en tapotant doucement les tubes. </li><li> Fixer les échantillons sur la glace pendant 10 minutes. Alternativement, les échantillons peuvent être conservés une nuit à 4 ° C dans l&#39;obscurité. Si cette dernière méthode est choisie, assurez-vous d&#39;être cohérent dans tous les tubes étiquetés avec l&#39;annexine V / PI (y compris les contrôles de compensation). </li><li> Ajouter 1 mL 1 x PBS - / - pour chaque échantillon et mélanger doucement en tapotant. </li><li> Centrifuger les tubes à 425 x g pendant huit minutes et décanter le surnageant. </li><li> Répétez les étapes 2.10 et 2.11. </li><li> Resuspendre le culot en feuilletant le tube. </li><li> Ajouter 16 uL d&#39;dilué à 1:100 Une RNase (Sigma, R4642) pour donner une concentration finale de 50 ug / ml. Incuber pendant 15 min à 37 ° C. </li><li> Ajouter 1 mL 1 x PBS - / - et mélanger doucement en tapotant. </li><li> Centrifuger les tubes à 425 x g pendant huit minutes. </li><li> Les échantillons sont maintenant prêts à être analysés. Alternativement, les échantillons peuvent être utilisés pour les étapes ultérieures, si coloration annexine / PI coloration est effectuée en parallèle avec d&#39;autres procédures. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs: Exemples de types de cellules et de lignées cellulaires qui présentent divers degrés de coloration PI faux-positifs sont présentés dans la figure 1. Pour tenir compte des événements de faux-positifs, les cellules ont été fixées puis traités à la RNase A. Il en résulte une diminution significative du nombre de faux positifs événements, comparativement aux cellules qui n&#39;ont pas subi un traitement RNase (figure 2B). La figure 2C montre des images représentant des cellules qui ont subi un traitement RNase, par rapport aux cellules qui n&#39;ont reçu aucun traitement RNase. La figure 3 montre comment la modification annexine V / PI protocole, avec fixation et étapes de traitement RNase, améliore les protocoles conventionnels en limitant le nombre d&#39;événements coloration de faux-positifs. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Conventionnel protocoles iodure de propidium coloration conduire à un nombre important de faux événements positifs. Nous avons déjà évalué l&#39;étendue de la coloration de faux positifs dans les cellules primaires à travers un large éventail de modèles animaux ainsi que dans une variété de 10 lignées cellulaires. Images représentant montrent l&#39;étendue de coloration de faux positifs dans les trois populations cellulaires uniques (une lignée cellulaire couramment utilisés - les macrophages RAW et deux cellules primaires - les macrophages murins de moelle osseuse (BMM) et les macrophages des poissons rouges rénale primaire (PKM)). Certes les événements positifs attendus afficher le co-localisation entre PI et DRAQ5 dans le compartiment nucléaire (zones jaunes représentent colocalisation entre PI et DRAQ5). DRAQ5 est très membraNE perméables colorant qui précise compartiment colorants nucléaires dans les deux cellules vivantes et mortes 10,11,12. Pour faciliter la détermination visuelle de la colocalisation DRAQ5 tache a été donnée une pseudo couleurs vertes. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Améliorer la précision du PI coloration nucléaire. (A) Nous avons évalué la précision de la PI coloration nucléaire basée sur le degré de similitude d&#39;un certain nombre de taches bien caractérisés nucléaire (BrdU, 7-AAD et DAPI) pour DRAQ5. BrdU est un nucléoside synthétique qui est incorporé dans l&#39;ADN des cellules en prolifération, et en tant que tels ne tache dans le compartiment nucléaire. 7-AAD a une forte affinité pour l&#39;ADN et, semblable à PI, ne peut pas traverser une membrane plasmique intacte. DAPI a également une forte affinité pour l&#39;ADN et le nucléaire, le plus couramment utilisé dans la coloration de microscopie à fluorescence. Le degré de similarité était&gt; 99% entre BrdU, 7-AAD, DAPI et DRAQ5, mettant en évidence leur capacité à bien tacher le noyau de la cellule en RAW 264.7 macrophages. En revanche, coloration cytoplasmique PI repose sur des protocoles classiques conduit à une diminution marquée de la similitude pour cent de coloration par rapport à DRAQ5. (B) Des résultats similaires sont observés dans deux cellules primaires testées: les macrophages murins de moelle osseuse (BMM) et les macrophages des poissons rouges rénale primaire (PKM). Incorporation de 50 ug / ml de RNase A au stade spécifique au sein de la procédure de coloration supprime coloration PI non nucléaire et augmente considérablement le degré de similitude par rapport à DRAQ5 coloration. (C) des images représentant des macrophages rénaux primaires montrent le degré de similitude des cellules avec et sans traitement RNase. Pour faciliter la détermination visuelle des différences entre les traitements, DRAQ5 a été donné un vert. Les zones jaunes représentent colocalisation entre BrdU et DRAQ5 et PI et DRAQ5. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Mise à jour annexine V / PI réduit significativement l&#39;apoptose fausses / événements nécrotiques. Primaire des macrophages rénaux Goldfish (PKM) ont été colorés avec conventionnels et modifiés annexine V / PI protocoles. Les diagrammes de dispersion illustrent l&#39;annexine V / PI tache dans PKM poissons rouges. Le nuage de points sur la gauche montre conventionnelle annexine V / PI coloration (pas de RNase) des cellules PKM. Le nuage de points sur la droite montre les cellules PKM colorés avec le V modifiés annexine / PI protocole (par la RNase). L&#39;addition de RNase en une réduction marquée de la coloration PI en raison de la suppression des fausses taches de positif. PKM cellules ont ensuite été analysées en fonction des populations distinctes dans les progéniteurs des cultures-précoce (EP), les monocytes (Mono) et les macrophages matures (Mat Mac). La réduction du nombre d&#39;événements positifs PI, en raison de l&#39;enlèvement de faux événements positifs est plus prononcé dans les grandes cellules macrophages matures que dans les petites cellules souches précoces. Les conclusions fondées sur des protocoles classiques aurait tort suggéré une corrélation positive dans la mort cellulaire des sous-ensembles de macrophages plus mature.

<ol>
	<li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labeled+Annexin+V.">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V.</a> J Immunol Methods. 184, 39-51 (1995).</li><li>Vermes, I., Haanen, C., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+apoptotic+cell+death.">Flow cytometry of apoptotic cell death.</a> J Immunol Methods. 243, 167-190 (2000).</li><li>Cornelissen, M., Philippe, J., De Sitter, S., De Ridder, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin+V+expression+in+apoptotic+peripheral+blood+lymphocytes:+An+electron+microscopic+evaluation.">Annexin V expression in apoptotic peripheral blood lymphocytes: An electron microscopic evaluation.</a> Apoptosis. 7, 41-47 (2002).</li><li>Fried, J., Perez, A. G., Clarkson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytofluorometric+analysis+of+cell+cycle+distributions+using+propidium+iodide.+Properties+of+the+method+and+mathematical+analysis+of+the+data.">Flow cytofluorometric analysis of cell cycle distributions using propidium iodide. Properties of the method and mathematical analysis of the data.</a> J Cell Biol. 71, 172-181 (1976).</li><li>Bacso, Z., Everson, R. B., Eliason, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+of+Annexin+V-binding+apoptotic+cells+is+highly+fragmented.">The DNA of Annexin V-binding apoptotic cells is highly fragmented.</a> Cancer Res. 60, 4623-4628 (2000).</li><li>Darzynkiewicz, Z., Bruno, S., Del Bino, G., Gorczyca, W., Hotz, M. A., Lassota, P., Traganos, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+apoptotic+cells+measured+by+flow+cytometry.">Features of apoptotic cells measured by flow cytometry.</a> Cytometry. 13, 795-808 (1992).</li><li>Kroemer, G., Dallaporta, B., Resche-Rigon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+death/life+regulator+in+apoptosis+and+necrosis.">The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis.</a> Annu. Rev. Physiol. 60, 619-642 (1998).</li><li>Denecker, G., Vercammen, D., Declercq, W., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+and+necrotic+cell+death+induced+by+death+domain+receptors.">Apoptotic and necrotic cell death induced by death domain receptors.</a> Cell Mol. Life Sci. 58, 356-370 (2001).</li><li>Faleiro, L., Lazebnik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspases+disrupt+the+nuclear-cytoplasmic+barrier.">Caspases disrupt the nuclear-cytoplasmic barrier.</a> J Cell Biol. 151, 951-959 (2000).</li><li>Rieger, A. M., Hall, B. E., Luong, L. T., Schang, L. M., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+apoptosis+assays+using+propidium+iodide+generate+a+significant+number+of+false+positives+that+prevent+accurate+assessment+of+cell+death.">Conventional apoptosis assays using propidium iodide generate a significant number of false positives that prevent accurate assessment of cell death.</a> J Immunol Methods. 358, 81-92 (2010).</li><li>Edward, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Use+of+DNA-specific+anthraquinone+dyes+to+directly+reveal+cytoplasmic+and+nuclear+boundaries+in+live+and+fixed+cells.">Minireview: Use of DNA-specific anthraquinone dyes to directly reveal cytoplasmic and nuclear boundaries in live and fixed cells.</a> Mol. Cells. 27, 391-396 (2009).</li><li>Njoh, K. L., Patterson, L. H., Zloh, M., Wiltshire, M., Fisher, J., Chappell, S., Ameer-Beg, S., Bai, Y., Matthews, D., Errington, R. J., Smith, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+analysis+of+the+DNA+targeting+bisalkylaminoanthraquinone+DRAQ5+in+intact+living+cells.">Spectral analysis of the DNA targeting bisalkylaminoanthraquinone DRAQ5 in intact living cells.</a> Cytometry Part A. 69, 805-814 (2006).</li></ol>

L&#39;annexine V / PI protocole présenté ici est une version modifiée de protocoles conventionnels et prend en compte la présence d&#39;ARN dans le cytoplasme, qui a également une forte affinité pour les PI. Introduction de la RNase A (50 pg / ml) après une étape de fixation de formaldéhyde à 1% en fin de la procédure de coloration améliore considérablement la précision de la PI coloration nucléaire. Pas d&#39;effets négatifs sont observés dans la PI coloration nucléaire ou de la membrane plasmique annexine V coloration. Sans RNase A de traitement, jusqu&#39;à 40% des résultats de PI tache peut conduire à de faux événements positifs, ce qui conduit à un impact potentiellement significatif et négatif sur les conclusions aval 10. Notre protocole de coloration modifiée annexine V / PI est simple et a été utilisé efficacement dans un large éventail de types de cellules (cellules primaires: les macrophages murins de moelle osseuse et des splénocytes; porcine cellules résidentes du poumon, les macrophages pulmonaires alvéolaires, mésentériques isole des ganglions lymphatiques, les leucocytes du sang périphérique , splénocytes, les cellules de blastoderme de poulet; macrophages goldfish rénale primaire; leucocytes du sang périphérique de carpe; lignées cellulaires: les macrophages RAW 264.7, Jurkat cellules T, les macrophages 3D4/31 porcine, le CCA-71 fibroblastes nageoires des poissons rouges, les cellules B 3B11 silure 10). Il est important de noter que les cellules sont touchés différemment par la coloration PI faux positifs, avec des cellules primaires ayant généralement un plus grand nombre de faux événements positifs 10. Les différences de coloration de faux positifs parmi PI ces populations cellulaires peut être partiellement attribuée à des différences dans la taille des cellules, mais peut aussi résulter de différences dans le contenu ARN. En tant que tel, l&#39;incorporation de cette procédure est particulièrement pertinent pour les systèmes expérimentaux qui utilisent, entre autres, les cellules subissant un stress génotoxique, les cellules traitées avec des médicaments du cycle cellulaire arrestation tels que la thymidine ou l&#39;hydroxyurée, les cellules infectées viralement, et des études sur les cellules embryonnaires, où la progression développementale est caractérisée par des changements discrets dans la synthèse d&#39;ARN cellulaire.

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1 x PBS-/-</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 x Annexin V Binding Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>556454</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Annexin V-Alexa Fluor 488</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes (Invitrogen)</td>
<td>A13201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Propidium iodide (PI)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P4864</td>
<td>1 mg/mL in H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>2% Formaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F1268</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase A from bovine pancreas</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>R4642</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DRAQ5</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biostatus</td>
<td>DR50050</td>
<td>Dilute 1:60 in 1 x PBS-/-</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

modified annexin v/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death

Les études de l&#39;apoptose cellulaire ont été significativement impacté depuis l&#39;introduction de la cytométrie de flux basé sur des méthodes. L&#39;iodure de propidium (PI) est largement utilisé en conjonction avec l&#39;annexine V afin de déterminer si les cellules sont viables, apoptose, ou nécrotiques par des différences dans l&#39;intégrité de la membrane plasmique et 1,2 perméabilité. L&#39;annexine V / PI protocole est une méthode couramment utilisée pour étudier les cellules apoptotiques 3. PI est utilisé plus souvent que d&#39;autres colorants nucléaires, car il est économique, stable et un bon indicateur de la viabilité cellulaire, basée sur sa capacité à exclure les colorants dans les cellules vivantes 4,5. La capacité de la PI pour entrer dans une cellule dépend de la perméabilité de la membrane; PI ne tache pas vivre ou début cellules apoptotiques en raison de la présence d&#39;une membrane plasmique intacte 1,2,6. À la fin de cellules apoptotiques et nécrotiques, l&#39;intégrité du plasma et les membranes nucléaires diminue 7,8, permettant PI à traverser les membranes, s&#39;intercaler dans les acides nucléiques, et afficher une fluorescence rouge 1,2,9. Malheureusement, nous constatons que conventionnelles annexine V / PI protocoles conduire à un nombre important de faux événements positifs (jusqu&#39;à 40%), qui sont associés à coloration PI de l&#39;ARN dans le compartiment cytoplasmique 10. Les cellules primaires et des lignées cellulaires dans un large éventail de modèles animaux sont touchés, avec de grandes cellules (nucléaire: les ratios cytoplasmique &lt;0,5) montrant la plus haute fréquence 10. Ici, nous démontrons une modification annexine V / PI méthode qui apporte une amélioration significative pour l&#39;évaluation de la mort cellulaire par rapport aux méthodes conventionnelles. Ce protocole prend avantage de modifications de la perméabilité cellulaire au cours de la cellule de fixation à promouvoir l&#39;entrée de la RNase A dans les cellules après coloration. Tant le moment et la concentration de la RNase A ont été optimisés pour l&#39;enlèvement de l&#39;ARN cytoplasmique. Le résultat est une amélioration significative par rapport conventionnels annexine V / PI protocoles (&lt;5% des événements avec coloration PI cytoplasmique).

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Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death

Une méthode précise pour l&#39;évaluation de la mort cellulaire est décrite. Le protocole améliore conventionnels annexine V / iodure de propidium (PI) des protocoles, qui affichent jusqu&#39;à 40% de faux positifs des événements dans des lignées cellulaires et cellules primaires à partir d&#39;un large éventail de modèles animaux.

Mise à jour annexine V / propidium Assay apoptose iodure permettant une évaluation précise de la mort cellulaire

Studies of cellular apoptosis have been significantly impacted since the introduction of flow cytometry-based methods. Propidium iodide (PI) is widely ...

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Research

JoVE Journal

Biology

102.4K vues.  University of Alberta. Une méthode précise pour l'évaluation de la mort cellulaire est décrite. Le protocole améliore conventionnels annexine V / iodure de propidium (PI) des protocoles, qui affichent jusqu'à 40% de faux positifs des événements dans des lignées cellulaires et cellules primaires à partir d'un large éventail de modèles animaux.

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Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways. One of the hurdles to its understanding has been the varied methods in correlating changes of key signaling events to differentiation efficiency. We describe here the use of a mouse embryonic stem (ES) cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. By scoring for contracting embryonic bodies (EBs) in a 96-well plate format, we can quickly quantify cardiogenic efficiency and identify crucial time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation in a time course following specific modulator treatments. The principal outlined here is not limited to cardiac induction alone, and can be applied towards the study of many other cell lineages. In addition, the 96-well format has the potential to be further developed as a high throughput, automated assay to allow for the testing of more sophisticated experimental hypotheses.

We describe the use of a mouse ES cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&#946;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. The method provides a standardized platform that reliably quantifies cardiogenic efficiency, and it is applicable to the study of other cell lineages.

Mise à jour embryonnaires de souris des cellules souches basée Assay pour quantifier l&#39;efficacité d&#39;induction cardiogénique

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

Recherche

Biologie

A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative positive or negative regulators of cell death. In this system, N. benthamiana leaves are co-infiltrated with a 35S driven expression cassette containing the gene to be analyzed, and the GUS vector pCAMBIA 2301 using Agrobacterium strain LBA4404 as a vehicle. Because live cells are required for GUS expression to occur, loss of GUS activity is expected when this marker gene is co-expressed with positive regulators of cell death. Equally, increased GUS activity is observed when anti-apoptotic genes are used compared to the vector control. As shown below, we have successfully used this system in our lab to analyze both pro- and anti-death players. These include the plant anti-apoptotic Bcl-2 Associated athanoGene (BAG) family, as well as, known mammalian inducers of cell death, such as BAX. Additionally, we have used this system to analyze the death function of specific truncations within proteins, which could provide clues on the possible post-translational modification/activation of these proteins. Here, we present a rapid and sensitive plant based method, as an initial step in investigating the death function of specific genes.

A &amp;#946;-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

Programmed cell death assays commonly used in mammalian systems such as DNA laddering or TUNEL assays, are often difficult to reproduce in plants. In combination with a GUS reporter system, we propose a rapid, plant based transient assay to analyze the potential death properties of specific genes.

Un β-glucuronidase (GUS) dosage basé mort cellulaire

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

L&#39;activation de l&#39;apoptose par micro-injection cytoplasmique du cytochrome C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and organs1,2,6,7. During development, toxic chemicals or genetic alterations can cause an increase in PCD or change PCD patterns resulting in developmental abnormalities and birth defects3-5. To understand the etiology of these defects, the study of embryos can be complemented with in vitro assays that use differentiating embryonic stem (ES) cells.
Apoptosis is a well-studied form of PCD that involves both intrinsic and extrinsic signaling to activate the caspase enzyme cascade. Characteristic cell changes include membrane blebbing, nuclear shrinking, and DNA fragmentation. Other forms of PCD do not involve caspase activation and may be the end-result of prolonged autophagy. Regardless of the PCD pathway, dying cells need to be removed. In adults, the immune cells perform this function, while in embryos, where the immune system has not yet developed, removal occurs by an alternative mechanism. This mechanism involves neighboring cells (called "non-professional phagocytes") taking on a phagocytic role-they recognize the 'eat me' signal on the surface of the dying cell and engulf it8-10. After engulfment, the debris is brought to the lysosome for degradation. Thus regardless of PCD mechanism, an increase in lysosomal activity can be correlated with increased cell death.
To study PCD, a simple assay to visualize lysosomes in thick tissues and multilayer differentiating cultures can be useful. LysoTracker dye is a highly soluble small molecule that is retained in acidic subcellular compartments such as the lysosome11-13. The dye is taken up by diffusion and through the circulation. Since penetration is not a hindrance, visualization of PCD in thick tissues and multi-layer cultures is possible12,13. In contrast, TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) analysis14, is limited to small samples, histological sections, and monolayer cultures because the procedure requires the entry/permeability of a terminal transferase.
In contrast to Aniline blue, which diffuses and is dissolved by solvents, LysoTracker Red DND-99 is fixable, bright, and stable. Staining can be visualized with standard fluorescent or confocal microscopy in whole-mount or section using aqueous or solvent-based mounting media12,13. Here we describe protocols using this dye to look at PCD in normal and sonic hedgehog null mouse embryos. In addition, we demonstrate analysis of PCD in differentiating ES cell cultures and present a simple quantification method. In summary, LysoTracker staining can be a great complement to other methods of detecting PCD.

We present a simple protocol to visualize regions of programmed cell death (PCD) in mouse embryos and differentiating embryonic stem (ES) cell cultures using a highly soluble dye called LysoTracker.

L&#39;utilisation de Lysotracker pour détecter la mort cellulaire programmée dans les embryons et la différenciation des cellules souches embryonnaires

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

Le / GFP-FLP Méthode tomate / FRT pour l&#39;imagerie en direct de mosaïque adulte<em&gt; Drosophila</em&gt; cellules photoréceptrices

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important checkpoints of apoptosis, including mitochondrial fragmentation, release of mitochondrial cytochrome c into the cytosol, activation of caspases, chromatin condensation, DNA damage, nuclear fragmentation, plasma membrane blebbing, cell shrinkage, cell surface exposure of phosphatidylserine, and formation of apoptotic bodies. Anastasis can occur when apoptotic stimuli are removed prior to death, thereby allowing dying cells to reverse apoptosis and potentially other death mechanisms. Therefore, anastasis appears to involve physiological healing processes that could also sustain damaged cells inappropriately. The functions and mechanisms of anastasis are still unclear, hampered in part by the limited tools for detecting past events after the recovery of apparently healthy cells. Strategies to detect anastasis will enable studies of the physiological mechanisms, the hazards of undead cells in disease pathology, and potential therapeutics to modulate anastasis. Here, we describe effective strategies using live cell microscopy and a mammalian caspase biosensor&#160;for identifying and tracking anastasis in mammalian cells.

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

Stratégies pour le suivi Anastasis, une cellule de survie Phénomène qui renverse apoptose

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown to allow to selective translation of specific mRNAs, which typically encode for proteins required for a particular stress response. Identification of these mRNAs, as well as the characterization of regulatory mechanisms responsible for selective translation has been at the forefront of molecular biology for some time. Polysome profiling is a cornerstone method in these studies. The goal of polysome profiling is to capture mRNA translation by immobilizing actively translating ribosomes on different transcripts and separate the resulting polyribosomes by ultracentrifugation on a sucrose gradient, thus allowing for a distinction between highly translated transcripts and poorly translated ones. These can then be further characterized by traditional biochemical and molecular biology methods. Importantly, combining polysome profiling with high throughput genomic approaches allows for a large scale analysis of translational regulation.

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

Évaluation de la sélective ARNm traduction dans les cellules de mammifères par polysome profilage

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

An Iodide-Yellow Fluorescent Protein-Gap Junction-Intercellular Communication Assay

Gap junctions (GJs) are cell membrane channels that allow diffusion of molecules smaller than 1 kDa between adjacent cells. As they have physiological and pathological roles, there is need of high-throughput screening (HTS) assays to identify GJ modulators in drug discovery and toxicology assays. A novel iodide-yellow fluorescent protein-gap junction-intercellular communication (I-YFP-GJIC) assay fulfills this need. It is a cell-based assay including acceptor and donor cells that are engineered to stably express a yellow fluorescent protein (YFP) variant, whose fluorescence is sensitively quenched by iodide, or SLC26A4, an iodide transporter, respectively. When iodide is added to a mixed culture of the two cell types, they enter the donor cells via the SLC26A4 transporter and diffuse to the adjacent acceptor cells via GJs where they quench the YFP fluorescence. YFP fluorescence is measured well by well in a kinetic mode. The YFP quenching rate reflects GJ activity. The assay is reliable and rapid enough to be used for HTS. The protocol for the I-YFP-GJIC assay using the LN215 cells, human glioma cells, is described.

Here, we present a protocol for a novel gap junction intercellular communication assay designed for the high-throughput screening of gap junction-modulating chemicals for drug discovery and toxicological assessment.

Un essai de Communication intercellulaire-jonction iodure-jaune Fluorescent Protein-Gap

Gap junctions (GJs) are cell membrane channels that allow diffusion of molecules smaller than 1 kDa between adjacent cells. As they have physiological and ...

Single Myofiber Culture Assay for the Assessment of Adult Muscle Stem Cell Functionality Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells leave their quiescent state and activate the myogenic program ultimately leading to the repair of damaged tissue concomitant with the replenishment of the muscle stem cell pool. Various factors influence muscle stem cell activity, among them intrinsic stimuli but also signals from the direct muscle stem cell environment, the stem cell niche. The isolation and culture of single myofibers with their associated muscle stem cells preserves most of the interaction of the stem cell with its niche and is, therefore, the closest possibility to study muscle stem cell functionality ex vivo. Here, a protocol for the isolation, culture, siRNA transfection and immunostaining of muscle stem cells on their respective myofibers from mouse EDL (extensor digitorum longus) muscles is provided. The experimental conditions outlined here allow the study and manipulation of muscle stem cells ex vivo including investigation of myogenic activity without the inherent need for in vivo animal experiments.

In this protocol an in vitro culturing and functional analysis method for muscle stem cells is described, which preserves most of their interactions with their endogenous niche.

Essai de culture de myofibère unique pour l’évaluation de la fonctionnalité des cellules souches musculaires adultes Ex Vivo

Adult skeletal muscle tissue harbors a stem cell population that is indispensable for its ability to regenerate. Upon muscle damage, muscle stem cells ...

Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay

The average lifespan of a neutrophil is less than 24 h, which limits basic research on neutrophils and the application of neutrophil studies. Our previous research indicated that multiple pathways could mediate the spontaneous death of neutrophils. A cocktail was developed by simultaneously targeting these pathways, caspases-lysosomal membrane permeabilization-oxidant-necroptosis inhibition plus granulocyte colony-stimulating factor (CLON-G), which prolonged the neutrophil lifespan to greater than 5 days without significantly compromising the neutrophil function. Concurrently, a reliable and stable protocol for assessing and evaluating neutrophil death was also developed. In this work, we show that CLON-G can prolong the neutrophil lifespan in vitro to more than 5 days, and we exhibit the lengthening of the neutrophil lifespan with FACS and confocal fluorescence microscopy. This report introduces procedures for the preparation of CLON-G and showcases an in vitro spontaneous death assay of neutrophils, which can be used for the study of neutrophils and for subsequently interrogating neutrophil death, thus providing a reliable resource for the neutrophil community.

Neutrophil Lifespan Extension with CLON-G and an In Vitro Spontaneous Death Assay

This protocol details the preparation of CLON-G to extend the neutrophil lifespan to greater than 5 days and provides a reliable procedure for evaluating neutrophil death with flow cytometry and confocal fluorescence microscopy.

Prolongation de la durée de vie des neutrophiles avec CLON-G et un test de mort spontanée in vitro

The average lifespan of a neutrophil is less than 24 h, which limits basic research on neutrophils and the application of neutrophil studies. Our previous ...