We are grateful to the past and present members of the laboratory, in particular Urszula Liwak, for critical discussion regarding polysome profiling protocols and sharing of data. This work was supported by operating grants from the Canadian institutes of Health Research, Cancer Research Society, and the National Science and Engineering Research Council of Canada to MH. MDF was supported by the Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award and the Ontario Graduate Scholarship, and this work forms part of her Ph.D. dissertation.

<ol>
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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+profiling:+new+views+of+translation,+from+single+codons+to+genome+scale.">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Profilage polysomique est une technique puissante qui permet la quantification de l&#39;état de la traduction des transcrits spécifiques dans différentes conditions de traitement. Il est une technique très simple dans son principe mais il nécessite plusieurs étapes d&#39;exécution, dont certains sont essentiels pour produire de bons profils de polysomes. Ces étapes clés sont les suivants: 1) utilisation de produits chimiques sans RNase et en plastique, 2) la préparation de bons gradients de saccharose (dans mon expérience, un 10-50% des gradients de saccharose qui fonctionnent le mieux pour résoudre efficacement 40 / 60S sous-unités et ARNm aux ribosomes liés), et 3 ) en utilisant des cellules qui sont en croissance exponentielle et pas plus de 80% de confluence afin de capturer les taux de conversion les plus élevés. Cette dernière étape doit être pris en considération lors de faire des traitements de cellules longs, tels que effet de choc ou de surexpression de gène, de sorte que la quantité de cellules à plaque sera une fonction de la quantité de cellules confluentes sont en fin d&#39;étude. Dans les résultats présenTed ici, polysome analyse de profil était un outil important pour évaluer rôle PDCD4 dans la régulation de la traduction de l&#39;IRES hébergeant les ARNm de XIAP et Bcl-xL 12. Le fait que nous ne voyons aucun changement dans les profils généraux de polysome sur PDCD4 knock-down (figure 1B) nous a permis de conclure que PDCD4 n&#39;a pas altéré la traduction cellulaire global dans les conditions de l&#39;expérience. Nous avons ensuite utilisé l&#39;analyse par RT-PCR quantitative pour déterminer la distribution de la protéine XIAP et Bcl-xL ARNm dans les cellules traitées avec les siRNA PDCD4 ou de contrôle. qPCR est une méthode de choix pour l&#39;analyse des profils de polysomes, par opposition à la norme RT-PCR ou transfert de Northern, car elle permet une plus quantitative que l&#39;analyse semi-quantitative de la distribution de l&#39;ARNm et pour la détection de changements subtils dans l&#39;efficacité de translation entre les traitements. Grâce à cette technique, nous avons pu montrer que la distribution des XIAP et Bcl-XL ARNm (exprimé en pour cent de l&#39;ARNm cible totale à travers le gradient) est significativement décalée dans polyribosomes lourds (ARNm avec un grand nombre de ribosomes qui leur sont associés) après PDCD4 knock-down (figure 1D, E), ce qui indique une augmentation de la traduction de ces ARNm. Cela a été confirmé en outre par une augmentation des niveaux de protéine XIAP et Bcl-xL, mais pas dans les niveaux d&#39;ARN à l&#39;état stationnaire (figure 1F, G). Fait important, la distribution de polysomes de la variante non-IRES de XIAP est restée inchangée entre les cellules traitées et non traitées (Figure 1C). En variante, l&#39;efficacité de translation peut être présenté comme un rapport de la teneur en ARNm de polysomes (habituellement des fractions 5 à 10) par rapport à monosomes (habituellement des fractions 2 à 4) 14. L&#39;utilisation de contrôles tout au long du protocole est important dans la validation de toute polysome profilage résultat, comme des pics observés à partir de lectures d&#39;absorbance à 254 nm ne peuvent pas eux-mêmes être attribuées à l&#39;ARN ribosomal (détergents, tels que le Triton X-100 absorbent fortement dans cette région du spectre et peut obscurcir 40 / 60S sommets au sommet du gradient). Gradients vierges sans lysat et / ou avec un tampon de lysat doivent être exécutés pour déterminer la contribution relative des tampons à l&#39;absorbance à 254 nm. Artefactual structures d&#39;ordre supérieur peuvent également conduire à des interprétations erronées de polysomes où il n&#39;y a en fait aucun (par exemple «pseudo-polysomes&quot; 20). Séquestrant magnésium (utilisé tout au long de la procédure de stabiliser les ribosomes 80S) avec l&#39;EDTA cation divalent chélateur ajoutée à lysats et à la mémoire tampon de gradient (20 mM pendant 15 min) provoque une séparation du ribosome en ses composantes de petite taille (40S) et de grande taille (60S des sous-unités). Ainsi, si les pics d&#39;absorbance enregistrées à 260 nm sont en effet polysomes, le traitement de l&#39;EDTA sera replier le profilé de telle sorte qu&#39;un seul maximum est observé à proximité de la partie supérieure du gradient correspondant à libérer l&#39;ARNm et des unités ribosomiques (données non présentées). Coïncidentavec l&#39;effondrement induit EDTA-du profil, tous les objectifs spécifiques analysés par qPCR devrait maintenant être trouvé au sommet de la pente. Le nombre de ribosomes associés à un ARNm est pas toujours un indicateur de l&#39;efficacité avec notamment l&#39;ARNm qui est en cours de traduction. En effet, il existe des contextes spécifiques dans lesquels traduction active sur polysomes devient au point mort 21,22 laquelle le lecteur doit être conscient de. Déterminer si oui ou non les transcriptions sont activement engagés avec la machinerie de traduction qui peut être fait par un) traitement de l&#39;échantillon avec la puromycine, qui, contrairement à l&#39;EDTA, provoque «run-off» des ribosomes qui sont activement translocation à travers un ARNm, ou b) le traitement de l&#39;échantillon avec homoharringtonine qui inhibe la translocation de seulement la première ribosome au niveau du codon de démarrage, provoquant de nouveau &quot;run-off&quot; de toutes les ribosomes de translocation en aval. L&#39;utilisation de transcriptions de contrôle pour l&#39;analyse qPCR est également critique. La Selection des transcriptions qui ne sont pas affectés par des conditions de traitement telles que certains gènes de ménage (GAPDH, actine, tubuline, la nucléoline), ARNm ribosomique (18S, Rpl13a) ou dans ce cas, la variante non-IRES du IRES de XIAP, est important dans vérifier si l&#39;effet du traitement sur la traduction est spécifique ou généralisée. Ces transcrits de commande peuvent être utilisés pour normaliser la distribution des ARNm analysés comme cela a été fait ici (XIAP et Bcl-xL ARNm ont été normalisées par rapport à l&#39;ARNm GAPDH et exprimé en pourcentage de la teneur en ARNm total représenté par la somme de la teneur en ARNm de chaque fraction ) ou encore, cibles et de contrôle ARNm peuvent être exprimées en valeurs absolues et présentés séparément. analyse qPCR des lysats d&#39;entrée (généralement de 10% du volume total) est une autre étape qui permettra de contrôler la distribution des ARNm spécifiques. Idéalement, la teneur en ARNm de transcription spécifique dans le lysat d&#39;entrée doit être comparable à la somme de la teneur en ARNm de l&#39;ensemble des 10 fractions analysées. Enfin, Une étape facultative pour contrôler pour le phénol: étape d&#39;extraction de chloroforme est à pic chaque fraction de polysome avec un transcrit in vitro ARNm rapporteur (comme CAT, le chloramphénicol acétyl-transférase) qui seront ensuite quantifié par qPCR et peut même être utilisé pour normaliser la données 14. Comme toute technique, le profilage polysome présente certaines limites. Le fait que généralement un minimum de 10 fractions (changements plus subtils dans l&#39;efficacité de traduction peut nécessiter 20 ou plus) doivent être collectées dans le but d&#39;avoir de belles distributions de polysome rend cette étape limitante, en ce sens que seul un maximum de 4 échantillons peut être analyse à la fois pour pouvoir manipuler aisément l&#39;extraction d&#39;ARN et l&#39;analyse par qPCR de 40 échantillons et les contrôles d&#39;entrée 4 à la fois. La taille de l&#39;échantillon peut facilement ajouter avec combien de transcriptions doivent être analysées et combien de qPCR réplique à faire, et cela peut être coûteux. Une autre limitation d&#39;un polysomal base-qPCR profilage unenalyse est qu&#39;il ne peut être fait sur une approche fondée sur les candidat (où les transcriptions pour analyser sont connus à l&#39;avance) et ne peuvent pas être appliquées pour l&#39;analyse du génome entier de traduction. Cependant, au début du 21 e siècle, les enquêteurs ont commencé à interroger leur ARN polysomal à un niveau génomique en utilisant puces à ADN 15 et, plus récemment, avec le séquençage de prochaine génération 16,17. Dans cette approche puissante, profilage polysomal est effectuée comme décrit dans ce protocole, sauf que plutôt que d&#39;effectuer des analyses qPCR de fractions individuelles, monosomes fractions (généralement fraction 2-4) et polysomes fractions (en général) des fractions sont regroupées et les variations dans la traduction globale analysés par puces à ADN ou du génome entier séquençage de l&#39;ARN. Ainsi avec cette approche, il est possible d&#39;évaluer l&#39;ensemble des ARNm dont la distribution des changements de polysomes à monosomes (diminution de traduction) ou vice-versa (augmentation de la traduction) à un traitement spécifiquement. Validation et quantification de la distribution des polysomes d&#39;ARNm spécifique peuvent être effectuées par qPCR. Une utilisation encore plus puissant du principe polysomal de profilage est profilage ribosome. Une nouvelle extension haut débit de cette technique a été signalé récemment que permet la surveillance simultanée de centaines de polysomes 23 fractions. Cela donne un avantage certain lorsque sondage efficacité traductionnelles des collections de mutants ou dans un des écrans ARNi à grande échelle. Profilage ribosome est une technique qui tire parti de séquençage de prochaine génération à la carte des fragments d&#39;ARN protégés par les ribosomes (empreintes des ribosomes) engagés dans la synthèse des protéines 24,25. Dans cette technique, la translocation des ribosomes peut être inhibée par le cycloheximide (réversible) ou émétine (irréversible), suivie par la lyse des cellules et la RNase digestion pour obtenir une population d&#39;empreintes ribosome. Les ribosomes sont enrichis, l&#39;ARN total est isolé, et de contaminer ribosomal et ARN ribosomique mitochondrial est retiré.empreintes d&#39;ARN de 26-28 nucléotides environ sont isolés, transcription inverse, transformée en une banque d&#39;ADNc et séquençage 26. Contrairement au profilage de polysome standard, cette approche identifie non seulement les ARNm spécifiques qui sont réglementés en translation mais donne également des informations ARNm spécifique à la résolution de codon comme la profession exacte et la densité des ribosomes le long d&#39;une transcription spécifique. Ceci est particulièrement intéressant pour les ARNm de certains modes de traduction tels que les ARNm IRES-hébergeant, car elle pourrait donner plus d&#39;informations sur où sur le ribosome-recrutement de transcription qui se passe.

Régulation de la synthèse protéique (traduction) est un processus cellulaire clé qui est intimement liée à la survie cellulaire. Étant donné que la traduction consomme plus de 50% de l&#39;énergie de la cellule, il est peu surprenant que la traduction est strictement réglementée et que les perturbations dans la traduction ne sont pas bien toléré. En revanche, de nombreux processus cellulaires aberrantes exiger que la machinerie de traduction et de sortie de traduction (par exemple du protéome) doivent être modifiés. Cela est souvent le cas dans divers états d&#39;intervention et de stress, les maladies et est probablement le meilleur exemple dans le cancer. Un avantage clé de contrôle de la traduction est la capacité des cellules à reprogrammer rapidement la production de la protéine en réponse à différents déclencheurs externes et internes, le mécanisme de réglage fin ainsi que pencher la balance entre la survie et la mort cellulaire 1. Deux aspects de contrôle de la traduction sont particulièrement intéressants; la compréhension de la nature de la régulation mechanism (s) et de contrôle des éléments qui permettent de traduction spécifique, et l&#39;identification des ARNm spécifiques et de leurs produits de protéines qui participent à la réponse cellulaire à la gâchette particulier qui a suscité traduction sélective en premier lieu. Polysomes profilage est une technique qui permet d&#39;étudier efficace des deux processus. L&#39;objectif global de la technique polysome de profilage est d&#39;étudier et de quantifier l&#39;état de la traduction des ARNm spécifiques dans des conditions cellulaires. Le principe de la technique est de capturer traduction de l&#39;ARNm par &#39;&#39; geler &#39;&#39; ribosomes traduisant activement sur différents transcrits et séparer les polyribosomes résultant par ultracentrifugation sur un gradient de saccharose, ce qui permet d&#39;établir une distinction entre les transcriptions très traduits (liée par plusieurs ribosomes) et les mal traduit (lié par un ou deux ribosomes). Dans ce protocole particulier, le cycloheximide antibiotique qui se lie à la60S de la sous-unité ribosomique et bloque la libération de déacétylé ARNt du site E ribosome 2, est utilisée pour inhiber la translocation du ribosome et caler ribosomes sur les ARNm de traduction. Cependant, d&#39;autres agents de blocage, tels que l&#39;émétine cette traduction aussi des blocs allongement 3, peut être utilisé. Contrairement à la Western blot et 35 S-méthionine techniques de marquage qui mesurent le résultat final du processus de traduction, polysome profilage a l&#39;avantage de mesurer les ribosomes association avec des ARNm activement traduits, ce qui permet une étude plus détaillée des mécanismes de traduction dans différentes conditions. Par conséquent, la technique peut être facilement adapté pour étudier spécifiquement les différents modes de traduction 4-6, facteurs de protéines impliquées dans la régulation de la traduction 7-9, les conditions de stress affectant la synthèse des protéines 1,10,11 ou les effets des structures d&#39;ARNm tels que IRES ou en amont cadres de lecture ouverts sur la protéine synthéSIAE 12-14. Aujourd&#39;hui, polysome Profilage des applications sont encore plus large avec l&#39;utilisation de puces à ADN 15 ou séquençage de nouvelle génération 16,17 à analyser polysomes associés ARNm.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="772">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Gradient Master 108 automated gradient maker</td>
			<td style="width:135px;">BIOCOMP</td>
			<td style="width:119px;">107-201M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Auto Densi-Flow two-chamber gradient maker</td>
			<td style="width:135px;">LABCONCO</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4517000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Beckman Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">Model # L-100-XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Density gradient fractionator</td>
			<td style="width:135px;">TELEDYNE ISCO</td>
			<td style="width:119px;">69-3873-246</td>
			<td>Composed of: tube piercing system,&#160; peristaltic pump, UA-6 Detector with 254 and 280nm filters and Foxy R1 Fraction Collector</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">WinDaq data acquisition software</td>
			<td style="width:135px;">DATAQ INSTRUMENTS</td>
			<td style="width:119px;">WINDAQ/LITE</td>
			<td>http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">Pollyallomer ultracentrifuge tubes (for SW41, 14x89 mm)</td>
			<td style="width:135px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (dolphin nose)</td>
			<td style="width:135px;">DiaMed</td>
			<td style="width:119px;">PRE1900-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Nuclease-free 2-ml centrifuge tubes (flat bottom)</td>
			<td style="width:135px;">SafeSeal</td>
			<td style="width:119px;">12000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sucrose (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">573113</td>
			<td>MW = 342.3 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Cycloheximide</td>
			<td style="width:135px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">C7698</td>
			<td>MW = 281.4 g/mol. Resuspend in DMSO and keep at -80C for long term sotrage. Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation. Wear mask when weighing.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sodium chloride (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">OmniPur</td>
			<td style="width:119px;">7710</td>
			<td>MW = 58.44 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">MgCl2.6H2O (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">OmniPur</td>
			<td style="width:119px;">5980</td>
			<td>MW = 203.3 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Tris Base (nucleases-free)</td>
			<td style="width:135px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:119px;">4109-01</td>
			<td>MW = 121.14 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:135px;">OmniPur</td>
			<td align="right" style="width:119px;">9400</td>
			<td>Caution: TOXIC! Can cause repiratory tracts and skin irritation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td style="width:135px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">N2515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">RNaseZap Rnase inactivation solution</td>
			<td style="width:135px;">Ambion, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL)</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td style="width:135px;">Ambion, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9722</td>
			<td>Caution: TOXIC ! Can cause repiratory tracts irritation as well as skin irritation and corrosion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of selective mrna translation in mammalian cells by polysome profiling

Régulation de la synthèse des protéines représente un point de contrôle clé dans la réponse cellulaire au stress. En particulier, des éléments de régulation de l&#39;ARN discret ont été montrés pour permettre à la traduction sélective des ARNm spécifiques, qui codent pour des protéines généralement nécessaires pour une réaction de stress particulier. L&#39;identification de ces ARNm, ainsi que la caractérisation des mécanismes de régulation chargées de la traduction sélective a été à la pointe de la biologie moléculaire pour un certain temps. Profilage polysome est une méthode pierre angulaire dans ces études. Le but de polysome profilage est de capturer traduction de l&#39;ARNm en immobilisant ribosomes traduisant activement sur différents transcrits et séparer les polyribosomes résultant par ultracentrifugation sur un gradient de saccharose, ce qui permet d&#39;établir une distinction entre les transcriptions très traduits et les mal traduits. Ceux-ci peuvent ensuite être en outre caractérisés par des méthodes de biologie moléculaire et de biochimie classiques. Surtout, p combinantolysome profilage haut débit avec des approches de génomique permet une analyse à grande échelle de régulation de la traduction.

Nous avons récemment décrit un nouveau rôle pour le suppresseur de tumeur PDCD4 comme un inhibiteur sélectif de la traduction des ARNm codant pour des inhibiteurs apoptotiques XIAP et Bcl-xL 12 IRES-hébergement. Profilage polysome était une technique clé pour démontrer l&#39;implication spécifique de PDCD4 dans la traduction IRES-médiation. Les cellules HEK293 ont été transfectées de manière transitoire pour épuiser les niveaux endogènes de PDCD4 (figure 1A) et ensuite soumis à une analyse polysomes profil. Nous avons observé que la réduction des niveaux de PDCD4 ne portent pas atteinte à la traduction cellulaire mondial, à en juger par l&#39;absence de changements dans le profil de polysome lorsque l&#39;on compare siCTRL et siPDCD4 cellules traitées (figure 1B). De même, la distribution de polysomes IRES non-XIAP variant de 19 est resté inchangé entre les cellules traitées et non traitées (Figure 1C). En revanche, polysome distribution des ARNm deux IRES-hébergeant, XIAP et Bcl-xL, a été modifiée de façon significative. En l&#39;absence de PDCD4 la distribution de ces deux ARNm est décalé dans ribopolysomes lourds (figure 1D, E). Depuis ce ne soit pas accompagnée de changements dans les niveaux de XIAP et Bcl-xL ARNm (figure 1F) ces résultats à l&#39;état stationnaire démontrent une amélioration de la traduction de la protéine XIAP et Bcl-xL dans les cellules avec des niveaux réduits PDCD4, qui a été confirmée par Western blot (Figure 1G). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52295/52295fig1highres.jpg" /> Figure 1:. Polysomes profilage identifie PDCD4 comme inhibiteur sélectif de la traduction XIAP et Bcl-xL (A) des cellules HEK293 ont été traitées avec ou PDCD4 siRNA contrôle (CTRL), le siRNA ciblant non, lysées et soumises à une analyse Western blot avec des anticorps anti-PDCD4 et des anticorps anti-nucléoline de vérifier l&#39;étendue de PDCD4 knock-down. (B) PDCD4 a été renversé comme dans (A) etLes lysats cellulaires ont été soumis à des polysomes profilage. Profil de polysome représentatif est montré dans le panneau supérieur; la distribution de l&#39;IRES de XIAP non (C), Bcl-xL (D), et d&#39;IRES de XIAP (E) par rapport à celui des ARNm de GAPDH est représenté comme le pour cent de l&#39;ARNm total (% de l&#39;ARNm) dans chaque fraction. (F) Steady les niveaux d&#39;ARNm -state ont été mesurés par RT-PCR quantitative en PDCD4 siRNA ou de contrôle (CTRL) siRNA cellules traitées. (G) Les lysats provenant de (A) ont également été soumis à une analyse Western blot avec des anticorps anti-XIAP, anti-Bcl-xL, et anticorps anti-nucléoline. (NB. Les données présentées dans la figure 1 ont été à l&#39;origine publié en 12) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52295/52295fig1large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

Évaluation de la sélective ARNm traduction dans les cellules de mammifères par polysome profilage

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

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Research

JoVE Journal

Biology

27.9K vues.  University of Ottawa. The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions. 

Vidéo: Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Analyse de la cinétique ARNm exportation nucléaire dans les cellules de mammifères par micro-injection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Recherche

Biologie

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analyse de la situation du cycle cellulaire dans les cellules de mammifères

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

Surveillance de la réplication plasmidique dans les cellules de mammifères en direct sur plusieurs générations par microscopie à fluorescence

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Analysis of Translation Initiation During Stress Conditions by Polysome Profiling

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. Alterations of this program can lead to the growth of damaged cells, a hallmark of cancer development, or to premature cell death such as seen in neurodegenerative diseases. Much of what is known concerning the molecular basis for translational control has been obtained from polysome analysis using a density gradient fractionation system. This technique relies on ultracentrifugation of cytoplasmic extracts on a linear sucrose gradient. Once the spin is completed, the system allows fractionation and quantification of centrifuged zones corresponding to different translating ribosomes populations, thus resulting in a polysome profile. Changes in the polysome profile are indicative of changes or defects in translation initiation that occur in response to various types of stress. This technique also allows to assess the role of specific proteins on translation initiation, and to measure translational activity of specific mRNAs. Here we describe our protocol to perform polysome profiles in order to assess translation initiation of eukaryotic cells and tissues under either normal or stress growth conditions.

Here, we describe a method to analyze changes in the initiation of mRNA translation of eukaryotic cells in response to stress conditions. This method is based on the velocity separation on sucrose gradients of translating ribosomes from non-translating ribosomes.

Analyse de la traduction Initiation Pendant conditions de stress par polysome profilage

Precise control of mRNA translation is fundamental for eukaryotic cell homeostasis, particularly in response to physiological and pathological stress. ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Profilage individuel embryonnaires humaines Cellules souches par RT-PCR quantitative

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Polysome Fractionnement et analyse des mammifères Translatomes sur une échelle de l&#39;ensemble du génome

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Mesure des niveaux Heme synthèse dans des cellules de mammifères

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

Une méthode facile pour des plantes polysomes Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

Sonder la cinétique de l’ARNm dans l’espace et le temps à Escherichia coli à l’aide de l’hybridation de fluorescence in situ à deux couleurs

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...