Nous remercions les membres du laboratoire Mariani à l&#39;aide du protocole édition. Ce travail a été financé par une subvention du CIRM formation postdoctorale (JLF), un stage CIRM PONTS (TZTT), l&#39;E. Robert et R. Wright mai Foundation (FVM) et de l&#39;Université de Californie du Sud (FVM).

1. Coloration Lysotracker des embryons de souris <ol><li> Générer des embryons de souris en plaçant les jeunes (5-6 semaines) femelles dans des cages goujons mâles. Surveiller les matins suivants pour l&#39;apparition d&#39;un bouchon vaginal indiquant que l&#39;accouplement a eu lieu. Si la femelle est enceinte, à midi ce jour-là est appelé 0,5 dpc (coït jours après). La procédure présentée ici est idéal pour les embryons 13.7 dpc. </li><li> Le jour embryonnaire d&#39;intérêt, euthanasier de la femelle selon des protocoles approuvés et enlever l&#39;utérus. Retirez les embryons de la caduque dans un plat de Pétri de 10 cm avec Tom Hanks BSS (sans rouge de phénol). Retirer les membranes extra-embryonnaires et ne rincer au moins un avec Tom Hanks BSS pour enlever les tissus extérieurs et le sang. </li><li> Préparer la solution de coloration Lysotracker embryon (5 mM dans Lysotracker Hanks BSS). Un volume pratique pour 1-2 litres est de 5 ml. Mélanger délicatement pour verser le colorant uniformément. </li><li> Ajouter embryons à la Solut coloration Lysotracker embryonion dans un microtube ou flacon et incuber à 37 ° C pendant 45 min. </li><li> Rincer délicatement dans BSS Hanks quatre fois, à 5 min à chaque lavage. </li><li> Fixer dans du paraformaldéhyde 4% pendant la nuit. </li><li> Rincer une fois dans BSS Hanks, 10 min, pour supprimer le correctif. </li><li> Déshydrater à travers une série de méthanol (50%, 75%, 80%, 100%, 5 min chaque étape) afin d&#39;éliminer la coloration de fond. Ceci est important pour obtenir un bon rapport signal sur bruit lors de l&#39;imagerie. </li><li> A ce stade, vous pouvez stocker les échantillons d&#39;embryons indéfiniment dans le méthanol à -20 ° C, à l&#39;abri de la lumière. </li></ol> Remarque: Un échantillon de tissu peut être pris à n&#39;importe quelle étape pour le génotypage d&#39;ADN, cependant, il peut être plus commode de prendre un échantillon juste avant le stockage de sorte que jusqu&#39;à cette étape tous les échantillons peuvent être traitées par lots. Prélever un échantillon de tissu à partir de la queue, branche, ou la tête de chaque embryon et mettre tous dans des tubes séparés. Réhydrater l&#39;échantillon de tissu et se préparer pour génotypageping. 2. Coloration Lysotracker de différencier les cultures ES <ol><li> Préparer corps embryoïdes via le 15 Méthode goutte pendante avec une densité de départ de 500 cellules par baisse de 20 ul. </li><li> Après 3 jours, le transfert des corps embryoïdes à la culture en suspension sur des boîtes de 10 cm de Petri non-adhérentes (c&#39;est à dire ceux qui sont utilisés pour les travaux bactériologiques). Culture pendant 5 jours, l&#39;évolution des médias tous les 2 jours. </li><li> Au jour 7, transférer les corps embryoïdes à gélatinisés diapositives de chambre de 8 puits (ajouter 0,1% de gélatine dans les chambres, attendre 5 min, supprimer et ajouter des médias). Transfert des corps embryoïdes 1-2 par chambre. </li><li> Culture pendant 10 jours, l&#39;évolution des médias tous les jours. Faire attention à placer la pipette à l&#39;angle de la chambre de coulissement de manière à ne pas perturber le corps embryoïdes attachés à la surface du verre. Aussi lors de l&#39;ajout de nouveaux médias également placer la pipette dans le coin de la chambre et de libérer les médias lentement. </li><li> Après 10 jours de culteure, pour induire l&#39;apoptose comme témoin positif, traiter une partie du puits avec 0,1 mM et 1,0 mM de H 2 O 2 (ajouter le H 2 O 2 à frais médias, mélanger, puis ajouter les cellules) pendant 60 min. Rincer deux fois avec du D-PBS et culture d&#39;une nuit dans les médias habituels. </li><li> Aspirer les médias existants et ajouter une solution de coloration Lysotracker cellulaire (500 Lysotracker nM (concentration finale) dans les médias, 300 ul par chambre). </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 15 min. </li><li> Rincer deux fois avec D-PBS, 2 fois 5 min chacun. </li><li> Fixer dans du paraformaldéhyde 4% pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Rincer deux fois avec du D-PBS, à 5 min. </li></ol> 3. Voir embryons Stained Lysotracker ou cultures ES <ol><li> Préparer les échantillons cellulaires pour la microscopie par l&#39;aspiration du D-PBS, enlever la chambre de la lame; séchage à l&#39;air pendant environ 5 minutes, et puis en ajoutant un milieu de montage aqueux (Vectashield au DAPI ou similaire). Placez une feuille barrière tout en drying pour diminuer le blanchiment du fluorophore. Montez embryons dans un plat creux en verre-dépression ou petite boîte de Pétri en Vectashield ou similaire. </li><li> Visualiser avec un microscope à dissection ou composé équipé d&#39;un rhodamine ou Texas Red filtre (Lysotracker ROUGE MDN-99, d&#39;excitation / émission: 577/590 nm). La coloration est généralement assez vif pour les expositions longues sont généralement pas nécessaires. </li></ol> 4. Quantification des résultats des techniques d&#39;imagerie <ol><li> Prenez des photos numériques de vos échantillons dans les mêmes conditions d&#39;exposition en mode manuel. </li><li> Ouvrez les images dans Adobe Photoshop ou un programme d&#39;imagerie semblable. Pour déterminer le montant de la coloration Lysotracker, sélectionnez le canal rouge et le seuil de l&#39;image (convertit l&#39;image en noir et blanc) de telle sorte que la coloration rouge est maintenant représenté par des pixels blancs. Sélectionnez les pixels blancs et utiliser la fonction histogramme pour obtenir le nombre total. </li><li> Utilisez le canal bleu de compterle nombre de noyaux dans le domaine. Il peut être utile de garder une trace du comte en annotant l&#39;image. </li><li> Enregistrer les valeurs et ensuite calculer le niveau de coloration moyenne par cellule. Répétez cette analyse avec le réglage du seuil de même pour toutes les images que vous souhaitez déguster. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Il est un modèle normal de la CPD au cours du développement embryonnaire qui peut changer quand un gène de facteur de croissance, tels que Sonic hedgehog (Shh), est enlevé 16,17. Depuis Lysotracker est un colorant petite molécule qui est hautement diffusible, l&#39;embryon entier peut être visualisé à évaluer les zones de la CPD, même au plus profond de l&#39;mésenchyme 12,13 La figure 1 montre le schéma de coloration pour Lysotracker normales et Shh -. / - Embryons de souris mutantes à 10.5dpc. A ce stade, la CPD est fortement augmentée dans Shh - / - embryons mutants, en particulier dans la branche et somite regions. Certaines parties de l&#39;embryon peuvent être visualisées dans l&#39;ensemble de montage à un grossissement supérieur (1B) afin d&#39;évaluer la tendance générale. Parties découpées peuvent également être sectionné avec un microtome vibrant (1C) ou un cryostat (DF) pour révéler les régions PCD plus en détail. Analyse TUNEL est mieux fait sur des coupes minces où la pénétration de la transférase terminale est moins problématique. Lysotracker coloration et un essai TUNEL peut être fait dans le même tissu (figure 1D-G). Ces résultats montrent que bien qu&#39;il n&#39;y ait pas une stricte corrélation entre 01h01 et Lysotracker coloration TUNEL, les grandes régions de chevauchement PCD considérablement. A plus fort grossissement, il est possible de voir que puncta tache positif avec le test TUNEL mais pas avec le colorant Lysotracker, puncta qui ne tache avec le colorant Lysotracker, et qui se chevauchent puncta coloration. Quand un EB est plaqué sur une surface revêtues de gélatine, de différenciation des cellules sera Migrate vers l&#39;extérieur. Après 10 jours de culture, les cellules se sont différenciées en une variété de types de cellules, y compris les neurones, les cellules musculaires, et les cardiomyocytes. Les cultures de la figure 2 contiennent des populations mixtes de ces types cellulaires, mais on pourrait adapter notre protocole d&#39;étudier la CPD d&#39;un type cellulaire d&#39;intérêt particulier. Par exemple, la CE pourrait être traitée avec de l&#39;acide rétinoïque pour améliorer la différenciation des neurones 19, puis le dosage Lysotracker pourrait être utilisée pour évaluer la mort neuronale dans des conditions différentes. Dans la culture de cellules souches embryonnaires normaux différenciés, il existe quelques cellules qui subissent la CPD et ceux-ci peuvent être détectées avec Lysotracker et / ou tests TUNEL (figure 2A). PCD peut être induite par un certain nombre de différents agents cytotoxiques tels que le peroxyde d&#39;hydrogène (H 2 O 2), qui induit des dommages oxydatifs et initie la voie apoptotique 20,21. A faible dose d&#39;H 2 O 2 augmente à la foisLysotracker et coloration TUNEL par rapport à l&#39;absence de traitement, alors que les résultats d&#39;une dose élevée dans le rétrécissement des cellules et Lysotracker répandue et la positivité TUNEL. À l&#39;instar des résultats de l&#39;embryon, il est possible de voir que lacrymaux coloration positive avec le test TUNEL mais pas avec le colorant Lysotracker, puncta cette tache seulement avec le colorant Lysotracker et lacrymaux qui se chevauchent coloration. La suite de l&#39;application d&#39;un agent cytotoxique qui induit apopotosis est comparée à des conditions de privation de sérum qui induisent l&#39;autophagie (figure 2D). Les cellules qui ont subi une période de privation de sérum (1 heure) présentent un modèle différent où Lysotracker et coloration TUNEL ne pas hautement corrélés. Lysotracker coloration est beaucoup augmenté par rapport aux cultures non traitées, mais la positivité TUNEL est à des niveaux normaux. Utilisant des outils standard disponibles dans Adobe Photoshop, coloration Lysotracker peut être quantifiée avec une méthode simple seuillagequi permet de calculer le niveau de coloration moyenne pour une population de cellules. Figure 3A-B montre comment une image de l&#39;échantillon ressemble pendant le processus de quantification. A partir d&#39;une image de base avec une coloration Lysotracker dans le canal rouge et les noyaux au DAPI teinté dans le canal bleu (panneau 3A), le canal rouge de cette image est seuillée pour convertir l&#39;image en noir et blanc et les pixels blancs sont ensuite sélectionnés et dénombrés (figure 3A). Un niveau seuil a été choisi qui représente le schéma de coloration Lysotracker. Comme pour toute méthode de quantification qui utilise des images, il est important d&#39;éviter de surexposer vos photos car cela pourrait potentiellement conduire à trop insister sur les différences. Le nombre des noyaux dans le domaine peut alors être pris en compte par regarder juste le canal bleu (figure 3B) et le marquage des noyaux en utilisant un outil de dessin comme un pinceau tout en comptant (figure 3B). On peut alors exprimer èmee niveau de la coloration par le calcul du niveau moyen de la coloration par cellule (nombre de pixels / Nombre de noyaux). Si l&#39;on veut utiliser cet algorithme pour grande par-put dépistage, la plupart des logiciels de dépistage peut mesurer la luminosité dans un canal particulier et ont aussi une fonction d&#39;identificateur d&#39;objet qui comptera noyaux dans un champ, mais pour les applications les plus typiques de la méthode manuelle est rapide et simple. Pour donner un exemple, une zone d&#39;échantillon à partir des figures 2A-C a été mesurée et les résultats confirment que l&#39;augmentation des concentrations de H 2 O 2 résultats dans un plus haut niveau de la coloration Lysotracker (figure 3C). <img src="/files/ftp_upload/4254/4254fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Coloration Lysotracker dans des conditions normales et Shh - embryons - /. A, A &#39;normaux et Shh -. / - Embryons de souris à 10,5 dpc, colorées avec Lysotracker rouge, monté dans Vectashield et photographié sousépifluorescente un microscope à dissection. Entre parenthèses indiquent l&#39;emplacement des pattes avant B, B &#39;patte avant de la normale et Shh -.. / - Embryons imagée à plus fort grossissement. Notez les domaines normales de la mort cellulaire, y compris la «zone nécrotique postérieur&quot; (marquées d&#39;un astérisque) et une région dans le mésenchyme proximal du bourgeon de membre (indiqué par une flèche). Membres null Shh présentent une coloration plus forte dans la partie médiane et distale . C, C &#39;. sections médiane à travers le bourgeon du membre antérieur de bourgeons de membres à la fois normales et nul. A noter la présence de la coloration dans le mésenchyme proximal (flèche) et l&#39;ARE (tête de flèche) du bourgeon du membre normal et la forte coloration dans le mésenchyme dorsal et ventral et distal dans le bourgeon de membre nulle. DF. La même section (12 microns, congelés section) a été imagé pour Lysotracker et coloration TUNEL (Roche 1684795). L&#39;article passe à travers la partie distale de la mesenc Shh nullHyme. La flèche pointe vers l&#39;ARE. Notez comment la tendance générale est très similaire en utilisant les deux méthodes, mais la coloration ne se chevauchent pas complètement. G, G &#39;. A un plus fort grossissement de l&#39;ARE et le mésenchyme, on peut voir à la fois la présence de points lacrymaux qui sont Lysotracker ou TUNEL-positives seulement ainsi que puncta qui se chevauchent coloration. <img src="/files/ftp_upload/4254/4254fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Lysotracker coloration dans des cellules ES différenciées. Différenciation des cellules ont été étalées sur lames 8-chambre, en l&#39;absence de LIF. Pour montrer comment Lysotracker et coloration TUNEL comparer, la voie de l&#39;apoptose a été induite avec 2 doses différentes de H 2 O 2, alors que la voie autophagie a été induite en utilisant 1 heure de privation de sérum. Ces images ont été prises avec un Zeiss LSM5 Microscope confocal A-A&#39;&#39;:. Cultures non traitées montrent une apoptose normale, comme indiqué par LysoTracker et coloration TUNEL. Le modèle en utilisant les deux techniques pour la plupart des chevauchements (flèches blanches), cependant, on peut voir un lacrymaux-uns qui sont Lysotracker positives seulement (flèches rouges) B-B&#39;&#39;, CC &quot;:. Traitement avec des quantités croissantes de H 2 O 2 stimule l&#39;apoptose . La plus faible dose montre plus Lysotracker et TUNEL lacrymaux positive par rapport aux cellules non traitées. La plus forte dose induit dans Lysotracker encore plus et TUNEL positif lacrymaux. Blanc flèches pointent vers coloration qui se chevauchent, tandis que les flèches rouges pointent vers lacrymaux qui sont positifs pour Lysotracker seulement. Il est également possible de voir lacrymaux qui ne sont que positif pour la coloration TUNEL (flèches vertes) DD &quot;:. privation de sérum peut induire l&#39;autophagie, qui peut stimuler une accumulation de matière dans les lysosomes et autophagolysosomes. Notez combien de points lacrymaux Lysotracker plus sont visibles par rapport aux cultures non traitées. TUNEL positif lacrymaux sont présents (dont la plupart se chevauchent Lysotracker tachement, les flèches blanches), cependant, le nombre n&#39;est pas beaucoup augmenté par rapport aux conditions non traités. En outre, dans des conditions de privation de sérum, Lysotracker seule lacrymaux positifs sont très répandues (flèches rouges). <img src="/files/ftp_upload/4254/4254fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Méthode de quantification pour évaluer le niveau de coloration dans une population de cellules à l&#39;aide d&#39;Adobe Photoshop. R: Une partie de la figure 2A a été choisi et le Lysotracker (rouge) et coloration au DAPI (noyaux, bleu) est montré dans ce groupe A &#39;:. Le canal rouge de la figure 3A a été seuillée pour le convertir en un noir et blanc sur l&#39;image. Les pixels blancs peuvent alors être sélectionnées et comptées en utilisant la fonction histogramme B-B &#39;:. Le canal bleu montre les noyaux et tout en les comptant, l&#39;image peut être annoté avec une fonction de dessin comme un pinceau C:. C&#39;est un exquantification d&#39;un échantillon suffisant de panneaux 2A-C. Les données sont représentées sous forme de pixels par noyaux. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4254/4254fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> .

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Trans. 36, 813-817 (2008).</li><li>Galluzzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes.</a> Autophagy. 4, 151-175 (2008).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Caractéristiques importantes de l&#39;apoptose comprennent la détection de lésions de l&#39;ADN avec le test TUNEL, ainsi que la détection de l&#39;activité des caspases (détectée par anticorps monoclonaux ou une molécule de liaison tels que ZVAD-fmk), l&#39;observation des changements cellulaires, et la présentation de la phosphatidylsérine (PS ) sur la surface de la membrane (détecté par l&#39;annexine V liaison). Il ya quelques inconvénients à chacune de ces épreuves. Par exemple, le terminal transfér...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td></td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Lysotracker Rouge MDN-99 </td><td> Invitrogen </td><td> # L-7528 </td><td></td></tr><tr><td> BSS Hanks </td><td> Invitrogen </td><td> 14025-076 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde </td><td> EMD </td><td> EM-PX0055-3 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> VECTEUR </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10 à 013 CV- </td><td></td></tr><tr><td> Non-acides aminés essentiels </td><td> Cellgro </td><td> 25-025-CI </td><td></td></tr><tr><td> Pyruvate de sodium </td><td> Cellgro </td><td> 25-000-CI </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.02 </td><td></td></tr><tr><td> Pen-Strep </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> b-mercaptoéthanol, 50 mM </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td></td></tr><tr><td> LabTek-II diapositives Chambre (8 puits) </td><td> Nalge Nunc International </td><td> 154534 </td><td></td></tr><tr><td> 0,1% de gélatine </td><td> Millipore </td><td> ES-006-B </td><td></td></tr><tr><td> PBS de Dulbecco (D-PBS) </td><td> Cellgro </td><td> 21-031 CV- </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Recettes solution Paraformaldéhyde 4% Pour 100 ml: <ol><li> Mélanger 4 g de paraformaldéhyde, 90 ml de H 2 O, et NaOH (une goutte de NaOH 2N). Le paraformaldéhyde ne vais pas entrer dans la solution jusqu&#39;à ce que vous avez ajouté un peu de NaOH pour augmenter le pH. </li><li> Mélanger et chauffer à 60 ° C jusqu&#39;à ce que toute la poudre est en solution (~ 10-20 min). Ne pas surchauffer. </li><li> Ajouter 10 ml ~ 10x PBS pour obtenir un volume final de 100 ml. </li><li> Conserver à -20 ° C en pratique (~ 10 ml ou 40 ml) ~ aliquotes. </li></ol> AVERTISSEMENT: Le paraformaldéhyde dans «jabot» forme (comprimé petites pastilles) est moins poudré et peut donc être mesurée à l&#39;extérieur d&#39;une hotte. Cependant, vous devez toujours porter un masque anti-poussière (N95au moins) pendant la manipulation. EB Culture, des Médias Pour 500 ml EB médias: <table border="1"><tbody><tr><td> DMEM: </td><td> 404,5 ml </td></tr><tr><td> FBS: </td><td> 75,0 ml </td></tr><tr><td> L-Glutamine: </td><td> 5,0 ml </td></tr><tr><td> Pénicilline / Streptomycine: </td><td> 5,0 ml </td></tr><tr><td> Non-acides aminés essentiels: </td><td> 5,0 ml </td></tr><tr><td> Pyruvate de sodium: </td><td> 5,0 ml </td></tr><tr><td> β-mercaptoéthanol: </td><td> 500ul </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

use of lysotracker to detect programmed cell death in embryos and differentiating embryonic stem cells

La mort cellulaire programmée (PCD) survient chez les adultes pour maintenir l&#39;homéostasie des tissus normaux et au cours du développement embryologique de façonner les tissus et organes 1,2,6,7. Au cours du développement, les produits chimiques toxiques ou des altérations génétiques peuvent entraîner une augmentation des PCD ou modifier les modes de CPD entraînant des anomalies du développement et des malformations congénitales 3-5. Pour comprendre l&#39;étiologie de ces défauts, l&#39;étude des embryons peut être complété par des tests in vitro qui utilisent différencier souches embryonnaires (ES) cellules. L&#39;apoptose est une forme bien étudiée de la CPD qui implique à la fois intrinsèque et extrinsèque de signalisation pour activer la cascade enzyme caspase. Modifications cellulaires caractéristiques comprennent bourgeonnement de la membrane, rétrécissement nucléaire et fragmentation de l&#39;ADN. D&#39;autres formes de PCD ne comportent pas l&#39;activation des caspases et peut être le résultat final de l&#39;autophagie prolongée. Quelle que soit la voie PCD, les cellules mourantes doivent être enlevés. Chez l&#39;adulte, les cellules immunitaires perform cette fonction, tandis que chez les embryons, où le système immunitaire n&#39;a pas encore développé, l&#39;élimination se fait par un autre mécanisme. Ce mécanisme implique les cellules voisines (appelés «non-professionnels» phagocytes) prennent une phagocytaire rôle qu&#39;ils reconnaissent la &quot;eat me&quot; signal sur la surface de la cellule mourante et engloutir l&#39;8-10. Après l&#39;engloutissement, les débris est amené vers le lysosome de la dégradation. Ainsi, indépendamment du mécanisme de PCD, une augmentation de l&#39;activité lysosomale peut être corrélée avec la mort cellulaire accrue. Pour étudier PCD, un test simple de visualiser les lysosomes des tissus épais et multicouches cultures de différenciation peut être utile. Lysotracker colorant est une molécule très soluble petit qui est retenu dans des compartiments subcellulaires acides tels que l&#39;11-13 lysosome. Le colorant est absorbé par diffusion et par la circulation. Depuis la pénétration n&#39;est pas un obstacle, la visualisation de la CPD dans les tissus épais et multicouches cultures est possible 12,13 </sup&gt;. En revanche, TUNEL (terminal désoxynucléotidyltransférase étiquetage dUTP fin nick) analyse 14, est limitée à de petits échantillons, coupes histologiques et des cultures monocouches parce que la procédure nécessite l&#39;entrée / la perméabilité d&#39;un terminal transférase. Contrairement aux Bleu d&#39;aniline, qui diffuse et est dissous par des solvants, Lysotracker Rouge MDN-99 est réparable, lumineux et stable. La coloration peut être visualisé par microscopie confocale fluorescente ou standard dans l&#39;ensemble du montage ou de l&#39;article à l&#39;aide aqueux ou à base de solvant milieux de montage 12,13. Ici, nous décrivons les protocoles utilisant ce colorant à regarder la CPD dans des conditions normales et sonores embryons de souris hérisson nulles. En outre, nous démontrons l&#39;analyse de la CPD dans la différenciation des cultures de cellules ES et de présenter une méthode de quantification simple. En résumé, la coloration Lysotracker peut être un excellent complément à d&#39;autres méthodes de détection de la CPD.

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Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Nous présentons un protocole simple de visualiser les régions de la mort cellulaire programmée (PCD) dans des embryons de souris et la différenciation de cellules souches embryonnaires cultures (ES) en utilisant un colorant hautement soluble appelée Lysotracker.

L&#39;utilisation de Lysotracker pour détecter la mort cellulaire programmée dans les embryons et la différenciation des cellules souches embryonnaires

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

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23.0K vues.  University of Southern California. Nous présentons un protocole simple de visualiser les régions de la mort cellulaire programmée (PCD) dans des embryons de souris et la différenciation de cellules souches embryonnaires cultures (ES) en utilisant un colorant hautement soluble appelée Lysotracker.

Vidéo: Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

Dissection de 6,5 embryons de souris DPC

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

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Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Dérivation de cellules souches hématopoïétiques de cellules souches embryonnaires murines

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Dérivation des cellules souches embryonnaires humaines par Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This pathology causes symptoms such as intermittent claudication (pain with walking), painful ischemic ulcerations, or even limb-threatening gangrene. It is generally believed that the vascular endothelium, a monolayer of endothelial cells that invests the luminal surface of all blood and lymphatic vessels, plays a dominant role in vascular homeostasis and vascular regeneration. As a result, stem cell-based regeneration of the endothelium may be a promising approach for treating PAD.In this video, we demonstrate the transplantation of embryonic stem cell (ESC)-derived endothelial cells for treatment of unilateral hindimb ischemia as a model of PAD, followed by non-invasive tracking of cell homing and survival by bioluminescence imaging. The specific materials and procedures for cell delivery and imaging will be described. This protocol follows another publication in describing the induction of hindlimb ischemia by Niiyama et al.1

The surgical procedure for delivery of embryonic stem cell-derived endothelial cells to the ischemic hindlimb is demonstrated, with non-invasive tracking by bioluminescence imaging.

Les cellules souches embryonnaires des cellules dérivées endothéliales pour traitement de l&#39;ischémie des membres postérieurs

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Préparation d&#39;embryons pour la microscopie électronique des Drosophile Tube cardiaque embryonnaire

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

L&#39;isolement et la dérivation de cellules germinales embryonnaires de souris

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Vidéo analyse bioinformatique des droits de croissance de la tige colonie de cellules embryonnaires

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

La différenciation des cellules souches embryonnaires en précurseurs d&#39;oligodendrocytes

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Cartographie sort des cellules souches embryonnaires humaines par la formation de tératome

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Dérivation efficace des ressources humaines précurseurs cardiaques et les cardiomyocytes à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules